【摘要】： 隨著恒牙胚的發(fā)育,乳牙到一定時期牙根逐漸吸收,導(dǎo)致牙冠脫落,由萌出的恒牙所代替的過程稱為乳恒牙替換。此過程是多因素、多細(xì)胞參與的復(fù)雜又嚴(yán)密的生理過程,目前的研究方向主要為乳牙根吸收和恒牙胚的發(fā)育�，F(xiàn)已證實,OC與OD是參與吸收乳牙根、牙槽骨等組織的重要功能細(xì)胞,并為恒牙胚的發(fā)育和萌出創(chuàng)建通道。但其作用機制尚不清楚,因此對OC的深入研究為進一步探討乳恒牙替換機制有著重要的意義。 骨保護素(OPG)是近年來骨代謝研究領(lǐng)域新發(fā)現(xiàn)的一種可溶性腫瘤壞死因子受體,具有抑制OC形成、分化和增加骨密度等功能,是抑制骨吸收的關(guān)鍵因子。在骨骼,OPG主要由成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。研究已證實,成骨細(xì)胞分泌OPG與其配體OPGL的結(jié)合可阻斷OC發(fā)生的RANKL/RANK信號通路,從而抑制破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖、分化、融合和成熟OC的激活。另外,Hakeda等發(fā)現(xiàn)OPG可通過結(jié)合OC表面F-肌動蛋白而直接抑制成熟OC的骨吸收活性。 目前,國內(nèi)外文獻中未見有OPG表達于OC的報道,而OPG在乳恒牙替換過程中所起作用的研究也未見報道。根據(jù)OC來源于造血細(xì)胞,由單個核前體細(xì)胞融合而成,而文獻中OPG高表達于單核細(xì)胞,推斷OC有可能表達OPG,進行自我調(diào)節(jié),抑制其本身的分化。為了探討OPG在乳恒牙替換期的OC和OD中有無表達,本研究一方面將犬乳恒牙替換過程分為乳牙根穩(wěn)定期、乳牙根吸收期、恒牙列期三個階段,采用IHC和ISH的實驗方法,分別從蛋白和mRNA水來檢測OPG在乳牙牙根、牙槽骨中的OD、OC和恒牙胚的成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞中的表達情況,初步探討了OPG在犬乳恒牙替換過程中可能的作用。另一方面參考了OC體外培養(yǎng)的文獻,用淋巴分離液從人外周血細(xì)胞中分離出PBMC進行培養(yǎng),培養(yǎng)液中加入1,25(OH)2 D3、M-CSF、RANKL對12d后出現(xiàn)的OLC采用IHC和ISH實驗方法,檢測了OPG在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的OLC中的表達情況,并分析了OPG對OLC形成和功能的調(diào)節(jié)作用。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下: 第一部分犬乳恒牙替換期OPG表達的研究 1.犬乳牙牙根穩(wěn)定期:犬乳牙牙根尚未發(fā)生生理性根吸收,乳牙根完整,乳牙根周圍牙槽骨未見吸收陷窩。恒牙胚處于牙冠發(fā)育階段,恒牙胚牙本質(zhì)、牙釉質(zhì)基質(zhì)開始形成。此時恒牙胚周圍牙槽骨處于改建期,可見少量OC位于牙槽骨吸收陷窩內(nèi)。此期牙槽骨的OC、OB OPG IHC及ISH染色陽性,提示一方面OB分泌OPG,通過結(jié)合OPGL負(fù)調(diào)節(jié)OC的分化。另一方面OC可能合成和分泌OPG,通過自我調(diào)節(jié),直接參與抑制其自身的分化與成熟,參與犬乳牙根穩(wěn)定期的骨質(zhì)改建。恒牙胚的成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞OPG IHC及ISH染色也為陽性,推測OPG可能參與恒牙胚的發(fā)育過程。 2.犬乳牙牙根吸收期:犬乳牙牙根發(fā)生生理性吸收,乳牙根面可見多數(shù)吸收陷窩,呈蠶食狀,陷窩中可見多核OD。牙囊周圍及接近牙胚的牙槽骨骨質(zhì)吸收活躍,陷窩內(nèi)可見多核OC,恒牙胚冠部牙本質(zhì)、牙釉質(zhì)進一步形成和礦化。此時可見OPG在乳牙根吸收面的OD、牙槽骨中的OC、OB IHC染色陽性,其中OC和OB染色灰度值較穩(wěn)定期顯著降低(P0.05),提示此期OPG蛋白表達增強,以防止牙槽骨和乳牙根的過度吸收;OC/OD、OBISH染色陽性,且OC染色灰度值顯著低于穩(wěn)定期(P0.05),提示此期OC合成、分泌OPG的功能代償性增強。恒牙胚的成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞OPG IHC及ISH染色也為陽性,提示OPG參與了恒牙胚的發(fā)育。 3.犬恒牙列期:乳牙脫落,恒牙萌出。牙槽骨OC和OB OPG IHC及ISH染色弱陽性,染色灰度值均顯著增加(P0.05),提示此期OC和OB OPG合成、分泌量明顯減少,牙槽骨處于骨質(zhì)改建較弱的時期。 第二部分體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞樣細(xì)胞OPG表達的研究 分別采用IHC及ISH方法,觀察體外培養(yǎng)OLC OPG表達的情況。 用倒置顯微鏡和HE染色觀察,3因子誘導(dǎo)培養(yǎng)PBMC 6d即可見一些細(xì)胞體積增大,12d后可見多核細(xì)胞形成,其中個別細(xì)胞體積巨大,胞核數(shù)目3-7個。取原代培養(yǎng)12d后的細(xì)胞爬片進行OC特征性染色鑒定,出現(xiàn)抗酒石酸酸性磷酸酶染色陽性的多核細(xì)胞,并且在與細(xì)胞共同培養(yǎng)的骨片上出現(xiàn)吸收陷窩,即為OLC。取所培養(yǎng)的OLC進行OPG IHC及ISH染色,結(jié)果均為陽性,證實體外培養(yǎng)人OLC中有OPG蛋白和mRNA的表達。 總之,本研究觀察到OPG表達于乳恒牙替換過程中的OC和體外培養(yǎng)的OLC中,可能通過間接、直接作用負(fù)調(diào)節(jié)OC和OD的分化和功能,使牙槽骨和乳牙根硬組織吸收處于嚴(yán)密控制之下,防止出現(xiàn)快速吸收的現(xiàn)象。
【圖文】：

圖 1 OPG 分子結(jié)構(gòu)示意圖1.1.3 OPG 的分布 OPG 的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有 4 種，長度分別為 2.4，4.2，6.5，3.0 kb。其中 2.4 kb 的 mRNA 為主要的一種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，編碼 401 個氨基酸OPG mRNA 具有廣泛的組織分布，在肝、心、肺、腎、胃、小腸、皮膚、

第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文1.4.2 OPGL/RANK/OPG系統(tǒng)對OC的調(diào)控作用 OPGL/RANK/OPG系統(tǒng)是近年來發(fā)現(xiàn)的在OC分化過程中的一個重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在OC的分化成熟過程中首先由ST/OB分泌M- CSF，M-CSF再與OC祖細(xì)胞表面的受體結(jié)合，然后RANKL再與OC祖細(xì)胞膜上的RANK結(jié)合，通過C-JunN-末端激酶（JNK）信號傳導(dǎo)通路、NF-B途徑、Akt途徑等介導(dǎo)OC的成熟。RANKL可促進 OC分化，，增強成熟OC的活力，阻止OC凋亡。RANK是RANKL發(fā)揮作用的惟一靶受體。三者之間的關(guān)系為OB/ST表達RANKL，與OC前體細(xì)胞或OC表面的RANK結(jié)合后，促進 OC的分化及骨吸收活性。OB/ST分泌表達OPG與 RANKL競爭性結(jié)合，阻止RANKL與RANK之間的結(jié)合，從而抑制OC前體的分化、存活和融合，降低成熟OC活性，誘導(dǎo)OC凋亡。三者間與OC形成分化的關(guān)系見圖2：
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R78

【參考文獻】

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本文編號：2709752