【摘要】： 目的： 牙齒美白技術(shù)已經(jīng)有一百多年的歷史,隨著審美水平的不斷提高,牙齒美白日益受到人們的青睞。雖然漂白劑已經(jīng)有了較多改進(jìn),但是其主要成分始終是高濃度的過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2),通過H202分解、形成大量的超氧化物自由基而發(fā)揮漂白作用,近年來(lái),為更快達(dá)到漂白效果,漂白劑的濃度有增高趨勢(shì),其安全性一直受到人們的關(guān)注。如漂白后的牙齒出現(xiàn)不同程度的過敏癥狀。研究證實(shí),H2O2具有細(xì)胞毒性,引起人牙齦成纖維細(xì)胞還原型谷胱甘肽減少,對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和活性有顯著影響。H2O2和過氧化脲能夠滲透牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)并進(jìn)入髓腔,髓腔內(nèi)的酶類明顯被抑制,但沒有造成不可逆性損傷。H2O2能否引起人牙髓細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的變化尚未見報(bào)告。 因此,本研究以體外培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞氧為研究對(duì)象,以人牙髓細(xì)胞內(nèi)氧化型、還原型谷胱甘肽和氧化型、還原型輔酶Ⅱ的含量為指標(biāo),同時(shí)檢測(cè)H2O2對(duì)人牙髓細(xì)胞活性和形態(tài)學(xué)的影響,從而可能為評(píng)估H2O2的安全性提供新方法,為漂白過程中采用低濃度的漂白劑和采取防護(hù)措施提供理論依據(jù)。 方法： 1、本研究采用組織塊酶消化法培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞；使用免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)所培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定；使用550酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度(A)值；使用蘇木素-伊紅染色法對(duì)人牙髓細(xì)胞進(jìn)行染色并觀察其形態(tài)學(xué)變化。 2、使用高效液相色譜法檢測(cè)H2O2作用后人牙髓細(xì)胞內(nèi)GSH和SSSG的含量,并進(jìn)一步得出GSSG/GSH的比值。 3使用分光光度法檢測(cè)H2O2作用后人牙髓細(xì)胞內(nèi)NADPH和NADP+的含量,并進(jìn)一步得出NADP+/NADPH的比值。 結(jié)果： 1、人牙髓細(xì)胞的培養(yǎng)及H2O2對(duì)人牙髓細(xì)胞活性和形態(tài)學(xué)的影響 本實(shí)驗(yàn)采用組織塊酶消化法成功培養(yǎng)出人牙髓細(xì)胞并順利傳代。經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定,提示細(xì)胞為間葉組織來(lái)源。 將人牙髓細(xì)胞種于96孔板,分組處理后加入10 ul CCK-8試劑,550酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A)值。隨著H2O2濃度增高,特別是0.4 mM H2O2組,作用時(shí)間延長(zhǎng),人牙髓細(xì)胞活性顯著下降。 將人牙髓細(xì)胞種于24孔板,分組處理后進(jìn)行蘇木素-伊紅染色(HE染色)。0.1 mM H2O2作用1-2h,光鏡下未見細(xì)胞形態(tài)有明顯變化,4h時(shí),光鏡下見細(xì)胞體積稍變小,細(xì)胞之間出現(xiàn)小間隙。0.2-0.4 mM H2O2作用1-4 h,光鏡下見細(xì)胞體積變小變圓,有的形成囊泡,細(xì)胞膜失去完整性,細(xì)胞之間失去正常的連接,有的細(xì)胞發(fā)生溶解,并隨濃度和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而愈加明顯。特別是0.4mM H2O2組,人牙髓細(xì)胞體積萎縮,細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)比例失調(diào),大部分細(xì)胞膜裂解,細(xì)胞死亡,細(xì)胞數(shù)量顯著減少。 2、H2O2對(duì)人牙髓細(xì)胞內(nèi)GSH、GSSG及GSSG/GSH的影響 0.1 mMH2O2組,GSH濃度隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而降低,GSSG隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而升高，GSSG/GSH隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而升高。0.2 mM和0.4 mM H2O2組,GSH和GSSG濃度隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而降低,GSSG/GSH隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而升高,提示人牙髓細(xì)胞的的氧化還原狀態(tài)向氧化方向偏移,但是0.4 mM H2O2作用時(shí)間為4 h時(shí),樣本中沒有檢測(cè)到GSH和GSSG。 3、H2O2對(duì)人牙髓細(xì)胞內(nèi)NADPH、NADP+及NADP+/NADPH的影響 0.1 mM H2O2組,NADPH濃度隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而降低,NADP+隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而升高,NADP+/NADPH隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而升高。0.2 mM和0.4 mM H2O2組,NADPH和NADP+濃度隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而降低,NADP+/NADPH隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而升高,提示人牙髓細(xì)胞的的氧化還原狀態(tài)向氧化方向偏移,但是0.4 mM H2O2作用時(shí)間為4 h時(shí),樣本中沒有檢測(cè)到GSH和GSSG。 結(jié)論： 1、組織塊酶消化法是培養(yǎng)原代人牙髓細(xì)胞的理想方法之一,H2O2降低人牙髓細(xì)胞的活性并能夠改變細(xì)胞的形態(tài)。 2、隨H2O2濃度的增高和作用時(shí)間延長(zhǎng),人牙髓細(xì)胞的的氧化還原狀態(tài)向氧化方向偏移。
【圖文】：

組織塊貼壁2一sd后倒置顯微鏡下可見到少量單個(gè)梭形的貼壁細(xì)胞，1周后可見貼壁組織塊周圍有細(xì)胞向外游出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)游出的細(xì)胞逐漸增多，圍繞在組織塊周圍呈放射狀向外生長(zhǎng)(圖2.1.1)，細(xì)胞達(dá)到70%一80%融合時(shí)可將細(xì)胞進(jìn)行消化、傳代。傳代后細(xì)胞可迅速貼壁且分布較為均勻，細(xì)胞多為梭形。傳代培養(yǎng)3d細(xì)胞形態(tài)多為飽滿的長(zhǎng)梭形或扁平狀的成纖維樣細(xì)胞，折光度好，核仁明顯。傳代培養(yǎng)sd后細(xì)胞形態(tài)大多為細(xì)長(zhǎng)成纖維細(xì)胞，呈平行排列生長(zhǎng)或旋渦狀生長(zhǎng)，細(xì)胞由單層逐漸變?yōu)槎鄬�，由松散變�(yōu)榫o密(圖2.1.2)，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。圖2.1.1原代培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞(10Ox)圖2.1.2第三代人牙髓細(xì)胞(100x)2.2人牙髓細(xì)胞組織來(lái)源鑒定人牙髓細(xì)胞的細(xì)胞漿中波形絲蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)

傳代培養(yǎng)3d細(xì)胞形態(tài)多為飽滿的長(zhǎng)梭形或扁平狀的成纖維樣細(xì)胞，折光度好，核仁明顯。傳代培養(yǎng)sd后細(xì)胞形態(tài)大多為細(xì)長(zhǎng)成纖維細(xì)胞，呈平行排列生長(zhǎng)或旋渦狀生長(zhǎng)，細(xì)胞由單層逐漸變?yōu)槎鄬�，由松散變�(yōu)榫o密(圖2.1.2)，當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。圖2.1.1原代培養(yǎng)的人牙髓細(xì)胞(10Ox)圖2.1.2第三代人牙髓細(xì)胞(100x)2.2人牙髓細(xì)胞組織來(lái)源鑒定人牙髓細(xì)胞的細(xì)胞漿中波形絲蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)，胞漿呈棕黃色，胞核無(wú)著色(圖2.2.1)，角蛋白呈陰性表達(dá)，胞漿無(wú)著色，細(xì)胞核呈藍(lán)色(圖2.2.2)，提示細(xì)胞為間葉組織來(lái)源。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R783

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2704220