【摘要】：目的：本實驗將EGF基因CDS片段亞克隆至腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-1，在體外重組至腺病毒載體pAd/BL-DEST，構建重組腺病毒載體，并轉染HEK293細胞進行腺病毒包裝，獲得重組腺病毒rAd-EGF。將重組腺病毒rAd-EGF在體外感染指數(shù)生長期人牙髓干細胞，分析人牙髓干細胞被轉染后EGF蛋白的表達情況，為后續(xù)實驗提供材料及數(shù)據(jù)。 方法：在體外用含有10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)人牙髓干細胞至第三代，鏡下觀察細胞貼壁及生長情況。雙酶切pCR4-TOPO-EGF及腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-1，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后分別回收EGF片段的帶和線狀pYr-adshuttle-1載體帶，連接轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，并進行擴增，提取重組質粒pYr-adshuttle-1-EGF，進行酶切鑒定。將鑒定正確的重組質粒采用體外同源重組將EGF表達框亞克隆至腺病毒表達載體pAd/PL-DEST，XbaI酶切重組腺病毒載體pAd-EGF，進行酶切鑒定。用PacI酶切pAd-EGF使重組腺病毒載體線性化后轉染包裝細胞HEK293，包裝成重組腺病毒rAd-EGF，PCR鑒定并測定病毒滴度。感染前24h取指數(shù)生長期的人牙髓干細胞根據(jù)實驗目的將其分為3組：重組腺病毒rAd-EGF感染組、對照腺病毒rAd-NC陰性對照組、空白對照組，當細胞密度達到70%時，感染組和陰性對照組加入100MOI重組腺病毒或對照腺病毒，空白組加等量DEME培養(yǎng)液，置于37℃、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時，更換培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM，培養(yǎng)48h后胰酶消化收集各組細胞進行Western-blot，檢測基因轉染后各組EGF的蛋白表達差異。 結果：人牙髓干細胞在鏡下成梭形或多角形，2~3個不等突起，生長情況良好。 pYr-ads-1-EGF經KpnI、XhoI酶切鑒定分析表明腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-1-EGF構建成功。pAd-EGF進行XbaI酶切鑒定和測序鑒定，確定和目的序列一致，腺病毒載體pAd-EGF構建成功。經PCR鑒定，重組腺病毒rAd-EGF包裝成功。重組腺病毒rAd-EGF感染DPSC細胞48h后，Western-blot檢測各組EGF的蛋白表達，結果顯示重組腺病毒rAd-EGF感染組的EGF的蛋白表達水平均顯著高于其他兩對照組(p0.05)。 結論：體外成功培養(yǎng)人牙髓干細胞至第三代，細胞生長良好，增殖情況正常。酶切鑒定表明成功構建了重組腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-1-EGF和重組腺病毒載體pAd-EGF后，采用HEK293細胞進行腺病毒包裝，最終獲得重組腺病毒rAd-EGF。采用重組腺病毒rAd-EGF成功轉人牙髓干細胞后，高表達EGF蛋白。說明腺病毒是一種有效的轉染載體，人牙髓干細胞是一種理想的基因載體細胞，，腺病毒介導的EGF基因可有效轉染人牙髓干細胞。
【圖文】：

3541 aagccccatt ctctcctatc agctaaccca ttatggcaac aaagggccct ggacccacca3601 caccaaatgg agctgactca gtga圖1. 腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-1Fig 1. Adenovirus shuttle vector pYr-adshuttle-12.2.1 以 pCR4-TOPO-EGF 為模板，PCR 擴增 EGF CDS 區(qū)片段。引物對為：EGF(KpnI---XhoI)：EGF-f:5'-GG GGTACC GCCACCATGCTGCTCACTCTTATCA-3' KpnIEGF-r:5'-CCG CTCGAG TCACTGAGTCAGCTCCATTT-3' NotIproduct：Length=3624+14+9=3647bp，GC%=46.5，Ta=51.1反應體系：

.3EGF 片段和載體 pYr-adshuttle-1 連接反應體系：Reagent Volume(μl)10xBuffer 2T4 DNA Ligase 2pYr-adshuttle-1 酶切片段 1EGF-PCR 片段 15Total 20ul上述液體輕輕混勻 4℃，過夜。好后的 pYr-ads-1-EGF 質粒圖譜，如圖 2 所示：
【學位授予單位】：瀘州醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R780.2

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本文編號：2702056