【摘要】： 前言 臨床上對(duì)各種原因引起的伴有牙齒缺失的較大范圍頜骨缺損患者進(jìn)行快速有效的功能性修復(fù)，即在修復(fù)頜骨缺損的同時(shí)完成種植體的Ⅰ期植入，以縮短患者缺牙時(shí)間、減輕患者多次手術(shù)的痛苦，盡早完成咬合、咀嚼、吞咽、發(fā)音等功能的修復(fù)，是口腔頜面外科、口腔種植科以及口腔修復(fù)科醫(yī)生所共同面對(duì)的一個(gè)難題。近年來(lái)組織工程學(xué)得到了快速的發(fā)展，其中以種子細(xì)胞、支架材料、生長(zhǎng)因子為核心內(nèi)容的骨組織工程技術(shù)，通過(guò)體外構(gòu)建細(xì)胞——支架復(fù)合體，即組織工程化骨，用于替代自體骨、異體骨、異種骨被認(rèn)為是最具潛力和發(fā)展前途的骨缺損修復(fù)材料。為提高頜骨缺損修復(fù)同期種植體植入的成功率，除需選擇理想的骨缺損修復(fù)材料之外，種植體表面特性也起到了重要作用。為此，本課題嘗試著以骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)為種子細(xì)胞、納米羥基磷灰石／膠原(nano-hydroxyapatite／collagen，nHAC)為支架材料、富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)為生長(zhǎng)因子來(lái)源，于體外構(gòu)建組織工程化骨用于修復(fù)兔下頜骨缺損，并于其中同期植入表面噴砂酸蝕處理的鈦種植體(sandblasted and acid-etched titanium，SLA-Ti)和表面噴砂酸蝕處理后羥基磷灰石涂層的鈦種植體(hydroxyapatite／sandblasted and acid-etched titanium，HA／SLA-Ti)，觀察組織工程化骨修復(fù)骨缺損的能力及其負(fù)載的兩種不同表面處理的種植體骨愈合能力的差別，具體內(nèi)容分為以下五部分： 一、富血小板血漿對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 目的探討自體PRP對(duì)體外培養(yǎng)的兔BMSCs生物學(xué)特性的影響。方法體外培養(yǎng)的兔BMSCs分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組中加入含1％PRP的DMEM條件培養(yǎng)基，對(duì)照組為不含PRP的DMEM培養(yǎng)基，在不同時(shí)間點(diǎn)收集兩組細(xì)胞，分別進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞周期分布和增殖指數(shù)測(cè)定、堿性磷酸酶(ALP)染色和活性測(cè)定、骨鈣素(OCN)含量測(cè)定以及骨橋蛋白基因(opn)mRNA相對(duì)表達(dá)量的分析。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞具有成骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征；PRP作用7d后S期細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯增加，細(xì)胞增殖指數(shù)由22.89±1.24增至33.15±1.02，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；實(shí)驗(yàn)組ALP染色呈陽(yáng)性，且ALP活性、OCN含量均較對(duì)照組明顯提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：opn mRNA相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組的3.48倍。結(jié)論P(yáng)RP可促進(jìn)兔BMSCs的增殖并可提高兔BMSCs的體外成骨潛能，使其向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。 二、納米羥基磷灰石／膠原對(duì)富血小板血漿促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨向分化的影響 目的探討nHAC作為支架材料對(duì)PRP體外誘導(dǎo)兔BMSCs向成骨細(xì)胞分化能力的影響。方法PRP分別作用于與nHAC聯(lián)合培養(yǎng)的兔BMSCs及常規(guī)培養(yǎng)的兔BMSCs，利用掃描電鏡觀察兔BMSCs在nHAC上的生長(zhǎng)情況；通過(guò)ALP活性測(cè)定、OCN含量測(cè)定以及opn mRNA相對(duì)表達(dá)量的分析，比較兩種培養(yǎng)條件下PRP誘導(dǎo)兔BMSCs向成骨細(xì)胞分化能力上的差異。結(jié)果聯(lián)合培養(yǎng)的兔BMSCs在nHAC上生長(zhǎng)良好，，其ALP活性、OCN含量均較常規(guī)培養(yǎng)明顯增加，且opn mRNA相對(duì)表達(dá)量是常規(guī)培養(yǎng)組的4.78倍。結(jié)論nHAC作為支架材料可明顯提高PRP誘導(dǎo)兔BMSCs向成骨細(xì)胞分化的能力。 三、鈦種植體噴砂酸蝕表面羥基磷灰石涂層對(duì)骨髓源成骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 目的探討HA／SLA-Ti對(duì)骨髓源成骨細(xì)胞(marrow-origin osteoblasts，MOOBs)生物學(xué)特性的影響。方法應(yīng)用離子束輔助沉積(ion beam assisted deposition，IBAD)技術(shù)在噴砂酸蝕(sandblasted and acid-etched，SLA)處理的鈦種植體表面制備羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)涂層，將MOOBs分別接種于HA／SLA-Ti和SLA-Ti表面，觀察其生長(zhǎng)情況，并對(duì)兩組MOOBs增殖指數(shù)、ALP活性、OCN含量以及opn mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行比較。結(jié)果MOOBs在HA／SLA-Ti表面生長(zhǎng)良好，其細(xì)胞增殖指數(shù)、ALP活性以及OCN含量明顯高于SLA-Ti組；且opn mRNA相對(duì)表達(dá)量是SLA-Ti組的3.25倍。結(jié)論應(yīng)用IBAD技術(shù)在鈦種植體SLA表面制備HA涂層，可明顯促進(jìn)MOOBs的增殖及其成骨表型的表達(dá)，是一種有應(yīng)用前景的種植體表面處理方法。 四、組織工程化骨修復(fù)兔下頜骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究 目的探討以兔BMSCs為種子細(xì)胞、nHAC為支架材料、PRP為生長(zhǎng)因子來(lái)源，于體外構(gòu)建的組織工程化骨修復(fù)兔下頜骨缺損的能力。方法兔下頜骨體部范圍為15mm×15mm的全層骨缺損分別采取相應(yīng)方法修復(fù)：A組，組織工程化骨修復(fù)；B組，自體髂骨修復(fù)；C組，單純nHAC材料修復(fù)；D組，空白對(duì)照組，缺損不做修復(fù)。分別于術(shù)后1、3、6個(gè)月取材，進(jìn)行大體標(biāo)本觀察、放射性核素骨顯像、骨密度測(cè)定及組織學(xué)觀察。結(jié)果大體標(biāo)本觀察顯示，術(shù)后A、B兩組骨缺損區(qū)域逐漸由新生骨組織修復(fù)，C組骨缺損區(qū)域僅形成了類軟骨樣組織，D組無(wú)骨組織形成，骨缺損區(qū)域由纖維結(jié)締組織充填；放射性核素骨顯像結(jié)果顯示，術(shù)后1個(gè)月、三個(gè)月時(shí)，A、B兩組成骨代謝能力明顯優(yōu)于C組、D組，而A、B兩組之間無(wú)顯著差異，術(shù)后6個(gè)月時(shí)，各組之間骨代謝能力無(wú)明顯差異；骨密度測(cè)定結(jié)果顯示A、B、C三組骨缺損區(qū)域骨密度逐漸增加明顯高于D組，術(shù)后3個(gè)月以后A組、B組骨密度較C組明顯提高，而A、B兩組之間無(wú)顯著差異；組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，A組在術(shù)后1個(gè)月時(shí)可見(jiàn)小片狀類骨質(zhì)出現(xiàn)，nHAC開(kāi)始降解，術(shù)后3個(gè)月時(shí)新生骨成大片狀結(jié)構(gòu)，術(shù)后6個(gè)月時(shí)nHAC幾乎全部降解，缺損由骨組織修復(fù)，其成骨量與B組無(wú)明顯差異卻明顯大于C組，D組僅為纖維組織修復(fù)。結(jié)論組織工程化骨修復(fù)頜骨缺損能力與自體髂骨相似而強(qiáng)于單獨(dú)使用nHAC，且nHAC材料于體內(nèi)可完全降解，因此BMSCs與nHAC及PRP復(fù)合所構(gòu)建的組織工程化骨是一種良好的骨缺損替代材料。 五、組織工程化骨修復(fù)兔下頜骨缺損同期不同表面處理的鈦種植體植入的實(shí)驗(yàn)研究 目的觀察組織工程化骨修復(fù)兔下頜骨缺損同期進(jìn)行HA／SLA-Ti和SLA-Ti種植體植入后，種植體與周圍新生骨組織發(fā)生骨整合的情況。方法兔BMSCs復(fù)合nHAC及PRP用于修復(fù)兔下頜骨頰側(cè)范圍為15mm×15mm的全層骨缺損，同期分別植入HA／SLA-Ti種植體(A組)和SLA-Ti種植體(B組)。術(shù)后1、3、6個(gè)月取材，進(jìn)行大體標(biāo)本觀察、X線檢查、掃描電鏡觀察、組織學(xué)檢查及種植體的推入實(shí)驗(yàn)和拉出實(shí)驗(yàn)。結(jié)果大體標(biāo)本觀察顯示，A組術(shù)區(qū)逐漸由新生骨組織修復(fù)，種植體周圍形成完善的骨結(jié)合界面，界面骨成熟；B組術(shù)區(qū)骨愈合狀態(tài)佳，但種植體周圍仍存在少量纖維組織。X線檢查結(jié)果顯示，術(shù)后1個(gè)月A、B兩組骨缺損區(qū)域骨密度較低，種植體周圍大部分為X線透射影；術(shù)后3個(gè)月A、B兩組骨缺損區(qū)域骨密度增加，與B組相比A組種植體周圍有較多X線阻射影；術(shù)后6個(gè)月A組種植體周圍為與正常骨組織密度相似的X線阻射影，B組種植體周圍也為與宿主骨密度接近的X線阻射影，但密度并非均勻一致。掃描電鏡結(jié)果顯示，A組種植體較B組種植體與周圍新生骨結(jié)合的更緊密。組織學(xué)檢查的結(jié)果顯示，A組新生骨與種植體表面直接結(jié)合，骨形成較B組種植體表面骨形成提前，B組種植體與新生骨之間存在纖維組織。推入實(shí)驗(yàn)和拉出實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，術(shù)后1個(gè)月時(shí)A、B兩組種植體的推入應(yīng)力和拉出負(fù)荷無(wú)明顯差異，術(shù)后3個(gè)月后A組種植體的推入應(yīng)力和拉出負(fù)荷明顯較B組提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論修復(fù)兔下頜骨缺損的組織工程化骨內(nèi)同期植入的種植體，可與新生的骨組織形成良好的骨結(jié)合，其中HA／SLA-Ti種植體的骨結(jié)合能力較SLA-Ti種植體強(qiáng)，且骨愈合時(shí)間也較后者提前。
【圖文】：

流式細(xì)胞儀檢測(cè)兔BMSCs表面抗原特性2、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察倒置相差顯微鏡下見(jiàn)，培養(yǎng)7d的對(duì)照組細(xì)胞與成纖維細(xì)胞相似，呈長(zhǎng)梭形態(tài)比較一致，呈魚(yú)群樣排列;而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞表現(xiàn)為成骨細(xì)胞樣形態(tài)，呈多角鱗片形，胞體較大，偽足多見(jiàn)，胞漿內(nèi)分泌物較多，繼續(xù)培養(yǎng)至14d時(shí)可見(jiàn)多層生長(zhǎng)，并有黑色結(jié)節(jié)生成(見(jiàn)圖2)。透射電鏡下見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胞漿內(nèi)大張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及大量的分泌空泡，線粒體較豐富并可見(jiàn)出胞現(xiàn)象(見(jiàn)圖3)。

倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)14d時(shí)ALP染色結(jié)果所示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞呈梭形或多角形，胞漿內(nèi)可見(jiàn)棕黑色陽(yáng)性著色，而對(duì)照組細(xì)胞胞漿內(nèi)未見(jiàn)棕黑色顆粒(見(jiàn)圖4)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組ALP含量均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加， 14d時(shí)達(dá)到高峰，之后ALP有所下降，從7d起實(shí)驗(yàn)組ALP含量較對(duì)照組明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(見(jiàn)表2)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R782

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2690428