【摘要】：外傷、先天畸形、口腔頜面部腫瘤術(shù)后等原因常造成頜骨組織的缺損,嚴(yán)重影響患者的顏面部美觀、導(dǎo)致咀嚼功能下降,給患者造成心理負(fù)擔(dān),從而影響患者的生活質(zhì)量,給患者帶來(lái)身心痛苦。在臨床上,骨缺損的治療一直是臨床醫(yī)師常見(jiàn)的、難以解決的、棘手的問(wèn)題。目前主要采用自體骨、異體骨、人工合成替代物來(lái)進(jìn)行修復(fù),盡管這些方法可在一定程度上恢復(fù)頜骨的功能和外形,但都存在一定的局限性,如:來(lái)源有限、供體部位繼發(fā)損傷、引起免疫排斥反應(yīng)、塑形性差等,不能完全滿足臨床上治療的需要。隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、組織工程和基因工程理論與實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展,組織工程骨成為頜骨修復(fù)重建的新方法,組織工程骨包含了3個(gè)要素:①間充質(zhì)干細(xì)胞和骨祖細(xì)胞的分離和擴(kuò)增;②合適的成骨生長(zhǎng)因子;③模擬促進(jìn)成骨的內(nèi)環(huán)境的支架。但外源性的成骨生長(zhǎng)因子存在著有半衰期、需要反復(fù)給藥、易流失、效率低、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。基因強(qiáng)化組織工程骨就是將外源性的編碼成骨生長(zhǎng)因子的基因轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞(種子細(xì)胞),使成骨生長(zhǎng)因子在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定、持續(xù)、高效地表達(dá)并分泌到局部發(fā)揮作用,從而促進(jìn)頜骨的修復(fù)和重建,成為解決該問(wèn)題的新思路。 組織工程骨的血管化也是影響較大體積組織工程骨是否成功的關(guān)鍵問(wèn)題,VEGF是一個(gè)強(qiáng)有力的促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子,具有內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原活性,在體內(nèi)能夠刺激血管的發(fā)生,增加血管的滲透性。在骨組織的發(fā)育、骨折愈合和骨缺損的修復(fù)中通過(guò)促進(jìn)血管的生成而間接發(fā)揮作用。所以VEGF可以成為組織工程血管化的候選生長(zhǎng)因子。VEGF除了促進(jìn)血管的生成而間接發(fā)揮作用外,對(duì)參與骨修復(fù)的細(xì)胞如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是否發(fā)揮作用以及其機(jī)制尚不清楚。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓內(nèi)含有的非造血干細(xì)胞,具有多向分化潛能,在特定的條件下能夠向成骨、成軟骨、成肌細(xì)胞等方向分化,容易獲取,來(lái)源豐富,并且外源基因易于導(dǎo)入細(xì)胞和表達(dá)的優(yōu)點(diǎn),是有前景的用于骨組織工程的種子細(xì)胞。 腺病毒載體是具有良好前景的一種高效基因轉(zhuǎn)移載體,腺病毒本身分子穩(wěn)定,不與宿主基因組整合,沒(méi)有基因毒性,不會(huì)引起插入突變,對(duì)靶細(xì)胞的病理?yè)p傷較小,分裂期和靜止期細(xì)胞都可以感染,感染效率高,已經(jīng)在臨床和臨床前研究中廣泛的應(yīng)用。腺病毒載體的基因表達(dá)僅維持幾周或幾個(gè)月,隨著靶細(xì)胞的死亡而消失。這點(diǎn)對(duì)于骨的修復(fù)和重建是有利的,因?yàn)橹幌Ｍl(fā)揮促進(jìn)成骨作用的蛋白在骨愈合的特定時(shí)間里表達(dá)和保持較高的濃度。 基于以上背景,本研究擬以腺病毒為載體,用VEGF基因轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)擴(kuò)增的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,研究VEGF對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,并闡述其機(jī)制。 首先,采用全骨髓貼壁法從大鼠骨髓中提取、分離和培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),細(xì)胞培養(yǎng)基為含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg /mL鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基,在培養(yǎng)48小時(shí)首次換液,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),為多角形、梭形,并有3-5個(gè)細(xì)胞突起,隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞逐漸增多,呈漩渦狀、輻射狀排列,并形成集落。培養(yǎng)至80-90%匯合時(shí)0.25%胰酶+0.02%EDTA傳代。第三代細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含抗壞血酸50mg/L、β-甘油磷酸鈉10mmol/L、地塞米松10~(-8)mol/L)內(nèi)培養(yǎng)21天,茜素紅染色,有礦化結(jié)節(jié)形成。在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含IBMX0.5mmol/L、地塞米松10μmol/L、胰島素10μmol/L、消炎痛200μmol/L)內(nèi)培養(yǎng)14天,油紅O染色有脂滴形成。結(jié)果表明體外成功培養(yǎng)和擴(kuò)增了大鼠BMSCs,在特定條件下能夠向成骨細(xì)胞分化,為以后的實(shí)驗(yàn)提供了細(xì)胞基礎(chǔ)。 第二,將攜增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的腺病毒載體(AdCMV-EGFP)以不同的MOI(0、100、200、400、600、800、1000particle/cell)轉(zhuǎn)染第3代大鼠BMSCs。結(jié)果為AdCMV-EGFP在0、100、200、400時(shí)轉(zhuǎn)染效率隨MOI的增加而逐漸增加,并且細(xì)胞的形態(tài)沒(méi)有變化,在MOI大于400時(shí)轉(zhuǎn)染效率不再增加,細(xì)胞出現(xiàn)變圓、脫落。在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后的24小時(shí)就有EGFP的表達(dá),5-7天時(shí)達(dá)到高峰,以后逐漸減弱,在轉(zhuǎn)染后28天時(shí)仍有較弱的熒光。經(jīng)AdCMV-EGFP轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)21天后,茜素紅染色,礦化結(jié)節(jié)形成的數(shù)量和大小與未轉(zhuǎn)染組沒(méi)有明顯區(qū)別。結(jié)果表明AdCMV-EGFP能夠有效的轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs,并且在一定的MOI范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞的形態(tài)和增殖沒(méi)有影響,而且也不影響B(tài)MSCs的成骨分化能力。 第三,按照上述確定的合適MOI(400particle/cell)攜VEGF的腺病毒載體(AdCMV-VEGF)轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs,采用RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)有VEGFmRNA的表達(dá),轉(zhuǎn)染后24小時(shí)采用ELISA方法在細(xì)胞培養(yǎng)上清中就檢測(cè)到有VEGF的表達(dá)和分泌,在轉(zhuǎn)染后第3天達(dá)到高峰,以后逐漸下降,并穩(wěn)定表達(dá)一定時(shí)間。MTT比色法實(shí)驗(yàn)檢測(cè)AdCMV-VEGF轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠BMSCs增殖的影響。結(jié)果表明AdCMV-VEGF能夠成功轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs,并且VEGF在mRNA和蛋白水平均有表達(dá),并能分泌到細(xì)胞外,分泌的VEGF能夠促進(jìn)大鼠BMSCs的增殖。 第四,按照上述確定的合適MOI(400 particle/cell)AdCMV-VEGF轉(zhuǎn)染大鼠骨BMSCs,并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng),在成骨誘導(dǎo)后6、9、12天進(jìn)行堿性磷酸酶活性檢測(cè),在第6天時(shí)沒(méi)有差異,在第9、12天轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的堿性磷酸酶活性高于未轉(zhuǎn)染組(p0.05)。在3、6、9、12天采用ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中OCN和COL?的含量,隨著時(shí)間延長(zhǎng)兩組的OCN和COL?的含量均逐漸增高,OCN在第12天和COL?在第6、9、12天轉(zhuǎn)染AdCMV-VEGF組的含量高于未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染AdCMV-EGFP組。在成骨誘導(dǎo)后3、7、14、21天采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞COL?、OCN、RUNX2和OSX的表達(dá),在第3天時(shí)4個(gè)基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)染AdCMV-VEGF組均高于未轉(zhuǎn)染對(duì)照組,表明轉(zhuǎn)染AdCMV-VEGF能夠促進(jìn)大鼠骨BMSCs成骨相關(guān)基因的表達(dá)。 最后,骨組織發(fā)育和修復(fù)是一個(gè)多種生長(zhǎng)因子參與的過(guò)程,因此本研究還用AdCMV-VEGF和AdCMV-BMP2共同轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs,從形態(tài)學(xué)角度觀察細(xì)胞的變化,并檢測(cè)VEGF和BMP2蛋白的表達(dá)情況。RT-PCR實(shí)驗(yàn)?zāi)z電泳顯示有VEGF和BMP2的目的條帶,細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)采用ELISA方法可在培養(yǎng)上清液中檢測(cè)到VEGF和BMP2的表達(dá),在轉(zhuǎn)染后第3天達(dá)到高峰。形態(tài)學(xué)觀察共同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞聚集形成結(jié)節(jié)的數(shù)目和面積大于單獨(dú)AdCMV-BMP2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。結(jié)果表明AdCMV-VEGF和AdCMV-BMP2共同轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs,并且VEGF和BMP2基因在細(xì)胞內(nèi)能夠轉(zhuǎn)錄和表達(dá),AdCMV-VEGF轉(zhuǎn)染能夠促進(jìn)AdCMV-BMP2轉(zhuǎn)染引起的BMSCs的成骨方向分化。 本研究采用腺病毒載體介導(dǎo)VEGF轉(zhuǎn)染BMSCs,研究了腺病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs的可行性,以及VEGF轉(zhuǎn)染對(duì)BMSCs功能的影響,為構(gòu)建血管化組織工程骨提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于將腺病毒為載體的VEGF轉(zhuǎn)染用于組織工程骨的研究,以及體外研究VEGF對(duì)BMSCS成骨分化的作用。
【圖文】：

30A （×100） B （×200）圖2.1 大鼠BMSCs培養(yǎng)2天(倒置顯微鏡)細(xì)胞接種2天首次換液后，貼壁細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞呈三角形、短梭形，散在分布。A （×100） B （×200）圖2.2 大鼠BMSCs5天 (倒置顯微鏡)在培養(yǎng)5天后，細(xì)胞數(shù)量增多，體積變大，仍見(jiàn)漂浮的血細(xì)胞。A （×100） B （×200）圖2.3 大鼠BMSCs7天(倒置顯微鏡)在培養(yǎng)7天后，細(xì)胞數(shù)量增多，呈輻射狀排列，形成集落。相關(guān)博士學(xué)位論文 2011年 第09期 醫(yī)藥衛(wèi)生科技輯 E072-141-36

細(xì)胞接種2天首次換液后，貼壁細(xì)胞數(shù)量較少，細(xì)胞呈三角形、短梭形，散在分布。A （×100） B （×200）圖2.2 大鼠BMSCs5天 (倒置顯微鏡)在培養(yǎng)5天后，細(xì)胞數(shù)量增多，體積變大，仍見(jiàn)漂浮的血細(xì)胞。A （×100） B （×200）圖2.3 大鼠BMSCs7天(倒置顯微鏡)在培養(yǎng)7天后，細(xì)胞數(shù)量增多，呈輻射狀排列，，形成集落。相關(guān)博士學(xué)位論文 2011年 第09期 醫(yī)藥衛(wèi)生科技輯 E072-141-36
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R739.8

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