天堂国产午夜亚洲专区-少妇人妻综合久久蜜臀-国产成人户外露出视频在线-国产91传媒一区二区三区

當前位置:主頁 > 醫(yī)學論文 > 口腔論文 >

膜引導結合Adv-BMP-2局部基因治療老年性骨缺損的實驗研究

發(fā)布時間:2020-05-19 22:48
【摘要】: 目的 探討在老年骨再生功能低下時應用膜引導結合Adv-BMP-2局部基因治療對骨缺損修復的促進作用,以尋找治療老年性骨缺損的有效方法。 1.成骨細胞的提取、體外培養(yǎng)和鑒定;Adv-BMP-2的擴增、純化、滴度測定;Adv-BMP-2對成骨細胞生物學行為的影響。 2.TNF-α對于成骨細胞生長的影響和對BMP受體表達的調(diào)控作用。 3.手術建立大鼠去勢后骨質(zhì)疏松牙槽骨缺損動物模型,為進一步的動物實驗奠定基礎。 4.應用體外法(ex vivo)進行BMP-2基因轉(zhuǎn)移,研究Adv-BMP-2對骨質(zhì)疏松大鼠牙槽骨缺損修復的成骨效果。 5.異體冷凍骨膜與e-PTFE膜復合紅骨髓對頜骨缺損成骨性能的比較分析。 6.通過老年大鼠骨質(zhì)疏松骨缺損動物模型,采用體內(nèi)法(in vivo)進行BMP-2基因轉(zhuǎn)移結合膜引導修復老年性骨缺損并與其他不同植骨材料進行比較,以尋找治療老年性骨缺損的有效方法。 方法 1.成骨細胞的提取、體外培養(yǎng)和鑒定。原代成骨細胞來自出生1周Wistar乳鼠,進行成骨細胞培養(yǎng),通過形態(tài)學觀察、ALP染色、體外礦化實驗,鑒定成骨細胞是否培養(yǎng)成功。Adv-BMP-2的擴增、純化、滴度測定。觀察成骨細胞轉(zhuǎn)染Adv-BMP-2后生物學行為的變化。 2.采用MTT及PNPP法檢測不同濃度TNF-α對于成骨細胞增殖和分化的影響。在保證細胞量相等的前提下,利用RT-PCR技術測定不同濃度TNF-α對于成骨細胞BMP受體表達的調(diào)控作用。 3.建立大鼠骨質(zhì)疏松牙槽骨缺損動物模型并通過各種檢測方法證實模型建立。40只3月齡雌性大鼠隨機分為4組,A組:S0組;B組:0VX組;C組:BD組;D組:0VX+BD組。術后8周、12周測定大鼠體重變化;血清中ALP、Ca、P含量及子宮重量系數(shù)變化;用雙能X線吸收法(DEXA)行頜骨密度和骨礦含量測定。 4.20只健康雌性Wistar大鼠,隨機分為2組。實驗組:A組為Adv-BMP-2轉(zhuǎn)染成骨細胞/CS組(A/C組);對照組:B組為去勢牙槽骨缺損對照組(OB組)。分別在第8周、第12周處死動物,獲取標本并行大體觀察、X線檢查、組織學檢查。 5.將健康Wistar大鼠斷頸法處死后取顱骨頂骨骨膜制備異體冷凍骨膜(variant deepfreeze periosteum,VDP)備用。24只成年Wistar大鼠隨機分為3組。于下頜骨升支部制造約0.5cm×0.5cm的骨缺損。A組:SO組:B組:e-PTFE/RBM組;C組:VDP/RBM組。分別在第4周、第8周處死動物,獲取標本行大體觀察、X線檢查、組織學檢查。觀察不同膜引導成骨性能的效果。 6.40只雌性,老年Wistar大鼠22月齡(體重330±32g),SPF級(無特定病原體動物),隨機將40只Wistar大鼠分為ABCDE五組:A組為SO組;B組為VDP/Adv-BMP-2/CS組;C組為VDP/Perioglas組;D組為VDP/HPPA組;E組為VDP/Adv- GFP/CS組。于下頜骨升支部制造約0.5cm×0.5cm的的全厚下頜骨缺損模型,BCD實驗各組分別植入不同材料。A組為對照組未植入任何材料,作為空白對照。分別于術后第8周、第12周處死動物。獲取標本并行大體觀察、X線檢查、組織學檢查、免疫組化檢查。E組行體內(nèi)綠色熒光蛋白成骨示蹤,觀察各組不同時期的新生骨量并進行統(tǒng)計學比較。 結果 1.成骨細胞體外培養(yǎng)形態(tài)觀察:成骨細胞初期為多角形,胞核呈橢圓形;培養(yǎng)1周,細胞為近立方狀,體積小、核圓。堿性磷酸酶(ALP)活性檢測:ALP活性是成骨細胞分化成熟的重要標志之一。體外培養(yǎng)擴增的細胞ALP染色和鈣化實驗均為陽性,證實培養(yǎng)的細胞具有典型的成熟成骨細胞的特征。Adv-BMP-2轉(zhuǎn)染后可提高成骨細胞增殖功能和分化功能。 2.本結果顯示當TNF-α濃度大于50ng/ml時對于成骨細胞增殖就有明顯的抑制作用。當TNF-α的濃度大于5ng/ml時對于成骨細胞分化有明顯抑制作用。不同濃度TNF-α均可以抑制BMP-IA和BMPR-Ⅱ基因的表達,但對BMP-IB卻有促進作用。 3.通過手術建立動物模型并進行各種指標監(jiān)測顯示,手術后12周已成功地制備了大鼠骨質(zhì)疏松牙槽骨缺損動物模型。為進一步的動物實驗奠定了基礎。 4.應用體外法(ex vivo)進行BMP-2基因轉(zhuǎn)移,并進行大體觀察、X線檢查和組織學檢查后發(fā)現(xiàn):Adv-BMP-2對于骨質(zhì)疏松大鼠牙槽骨缺損修復有明顯的促進作用。 5.VDP及e-PTFE不同引導膜修復大鼠下頜骨缺損并與空白對照組比較。術后8周結果顯示:VDP及e-PTFE膜組都有新骨形成并遍布整個骨缺損區(qū)。而對照組顯示:除邊緣有少量骨組織外骨缺損區(qū)充滿纖維結締組織。VDP及e-PTFE膜都可引導骨缺損形成骨組織。 6.采用體內(nèi)法(in vivo)進行BMP-2基因轉(zhuǎn)移結合膜引導修復老年性骨缺損并與其他不同植骨材料進行比較。結果發(fā)現(xiàn)不同種類的生物材料直接影響界面區(qū)早期的組織反應,膜引導結合Adv-BMP-2比其它材料較早地引導了新骨形成。 6.1.X線觀察:術后8周對照A組骨缺損區(qū)界線清楚,缺損邊緣可見少量高密度影。實驗B組、C組、D組骨缺損區(qū)域均有呈絮狀或云霧狀密度增高影,材料與骨界限清楚,各組差異不明顯。術后12周:對照組仍有約2mm左右的骨缺損。B組缺損修復區(qū)骨密度最高,新生骨組織覆蓋缺損,缺損處密度與周圍骨質(zhì)基本相似,交界已模糊不清。C組、D組缺損也己完全修復,交界線也模糊不清,但缺損處密度略低于周圍骨組織。 6.2.組織學觀察:術后8周對照A組骨缺損區(qū)周邊可見成骨細胞及少量成骨,骨缺損中心區(qū)可見大量纖維結締組織形成。實驗B組、C組、D組有不同程度成骨。B組移植骨周邊誘導骨明顯增加,成骨細胞增生活躍;新骨自四周向中心堆積,鈣鹽沉積增多。C組可見部分區(qū)域Perioglas白色透明顆粒樣成骨材料基本溶解,周圍留下一些顆粒溶解的空腔,在其周圍形成許多基骨。僅少部分材料周圍有薄層的結締組織,在顆粒間隙可見有明顯的骨母細胞、骨細胞、骨樣組織。D組所有材料周圍均有大量類骨質(zhì)生成,但類骨質(zhì)的鈣化程度以及基質(zhì)中細胞形態(tài)都有差異。材料已牢固地與骨組織連成一片,新骨組織包繞材料,新生骨改建明顯。術后12周對照A組骨缺損區(qū)邊緣有少量新骨沉積,腔內(nèi)被纖維組織充滿。成骨細胞和類骨質(zhì)仍局限在兩端,缺損中央被纖維結締組織充填,血管少,未見成骨現(xiàn)象。B組缺損處幾乎被新生骨組織充填,僅存少許纖維組織,周邊可見骨小梁形成。C組白骨缺損中心到邊緣區(qū)域的新生骨均由骨橋連結起來,Perioglas降解后留下的空腔已完全被新生骨取代。骨缺損部位骨樣組織、骨組織進一步增多。D組HPPA植入后材料基本由骨組織覆蓋,新骨形成明顯,鈣化程度高,晶界模糊。 6.3.統(tǒng)計分析結果:術后8周B組優(yōu)于C組(P<0.05)和D組(P<0.05);C組與D組兩組差異無顯著性意義(P>0.05)。術后12周B組、C組、D組明顯優(yōu)于A組(P<0.01)。 6.4.大鼠體內(nèi)綠色熒光蛋白成骨示蹤:E組移植術后2周冰凍切片和連續(xù)石蠟切片,在熒光顯微鏡下觀察,均可見移植部位呈發(fā)射綠色熒光的網(wǎng)狀支架材料并可見成骨細胞。移植后4周冰凍切片和連續(xù)石蠟切片,在熒光顯微鏡下觀察,仍可見移植部位呈發(fā)射綠色熒光的網(wǎng)狀支架材料及成骨細胞。 結論 1.體外實驗證實:Adv-BMP2對成骨細胞增殖功能和分化功能有明顯促進作用。為后續(xù)BMP-2基因治療的應用研究奠定了基礎。 2.當TNF-α濃度大于50ng/ml時對于成骨細胞增殖就有明顯的抑制作用。當TNF-α的濃度大于5ng/ml時對于成骨細胞分化有明顯抑制作用。不同濃度TNF-α均可以抑制BMP-IA和BMPR-Ⅱ基因的表達,但對BMP-IB卻有促進作用?傮w說來,TNF-α對于BMPR復合體起抑制作用。 3.可以手術制備大鼠骨質(zhì)疏松牙槽骨缺損動物模型,為進一步的動物實驗奠定基礎。 4.體外法(ex vivo)進行BMP-2基因轉(zhuǎn)移修復骨質(zhì)疏松牙槽骨缺損,Adv-BMP-2對于骨質(zhì)疏松大鼠牙槽骨缺損修復有明顯的促進作用。 5.VDP及e-PTFE不同引導膜都可引導大鼠頜骨缺損骨組織修復。 6.體內(nèi)法(in vivo)進行BMP-2基因轉(zhuǎn)移結合膜引導修復老年大鼠骨缺損比其它材料較早地引導了新骨形成,是一種理想的骨組織替代材料。特別是對老年骨再生能力低下骨缺損的修復有明顯的促進作用。
【學位授予單位】:山東大學
【學位級別】:博士
【學位授予年份】:2008
【分類號】:R782

【引證文獻】

相關期刊論文 前1條

1 茹嘉;李強;;最新進展的轉(zhuǎn)基因技術在骨與軟骨缺損修復中的應用[J];中國組織工程研究;2013年02期

,

本文編號:2671601

資料下載
論文發(fā)表

本文鏈接:http://www.sikaile.net/yixuelunwen/kouq/2671601.html


Copyright(c)文論論文網(wǎng)All Rights Reserved | 網(wǎng)站地圖 |

版權申明:資料由用戶4af2f***提供,本站僅收錄摘要或目錄,作者需要刪除請E-mail郵箱bigeng88@qq.com