【摘要】： 目的：觀察三種不同fimA基因型P.gingivalis-LPS對(duì)HUVEC產(chǎn)生致炎細(xì)胞因子、趨化因子以及黏附分子的影響,初步探討P.gingivalis感染在AS發(fā)生和發(fā)展的可能作用以及作為牙周炎與AS相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)的可能。 方法：厭氧培養(yǎng)ⅠfimA型(ATCC 33277)、ⅡfimA型(WCSP115)、ⅣfimA型(W83)P.gingivalis,采用熱酚-水法提取P.gingivalis-LPS,應(yīng)用SDS-PAGE+銀染、紅外線光譜分析、鱟試驗(yàn)對(duì)提取的脂多糖予以鑒定；體外培養(yǎng)HUVEC,待HUVEC單層融合后,分別加入不同終濃度的P.gingivalis-LPS,共同培養(yǎng)2h、6h、24h,應(yīng)用ELISA法測(cè)定培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8和MCP-1的分泌量；提取HUVEC總RNA, RT-PCR法檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1 mRNA表達(dá)水平,FCM技術(shù)檢測(cè)HUVEC表面ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)量。 結(jié)果：(1)本實(shí)驗(yàn)研究條件下所提取的P.gingivalis細(xì)菌物質(zhì)經(jīng)紅外光譜分析和SDS-PAGE電泳分析,表明其結(jié)構(gòu)與Ecoli-LPS相似,系P.gingivalis-LPS,鱟試驗(yàn)表明所提取的P.gingivalis-LPS具有較高的生物學(xué)活性(≥15ng/ml),可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。 (2)3型P.gingivalis-LPS作用于HUVEC后,細(xì)胞表達(dá)IL-1β蛋白水平及mRNA水平升高,在較高濃度(5、10μg/ml)時(shí),Ⅱ型fimA P.gingivalis-LPS刺激HUVEC IL-1β蛋白水平及mRNA的表達(dá)強(qiáng)于Ⅰ型fimA P.gingivalis-LPS。 在3型P.gingivalis-LPS刺激下,HUVEC IL-6水平的升高發(fā)生在轉(zhuǎn)錄mRNA水平和轉(zhuǎn)錄后蛋白水平,且存在著濃度依賴(lài)效應(yīng)；不同fimA基因型P.gingivalis-LPS刺激作用存在著差異。在蛋白水平上,Ⅱ型和Ⅳ型fimA基因型P.gingivalis-LPS刺激作用強(qiáng)于Ⅰ型fimA基因型P.gingivalis-LPS,但上調(diào)作用出現(xiàn)較晚。在mRNA水平上,Ⅱ型fimA基因型P.gingivalis-LPS刺激HUVEC表達(dá)IL-6 mRNA的作用較強(qiáng)。 在3型P.gingivalis-LPS刺激下,HUVEC TNF-α蛋白水平及mRNA的表達(dá)量上調(diào),且存在著濃度依賴(lài)效應(yīng),蛋白水平在24h時(shí)表達(dá)量達(dá)到高峰。在一些濃度下,Ⅱ型fimAP.gingivalis-LPS刺激HUVEC TNF-α蛋白水平比Ⅳ型fimA P.gingivalis-LPS的作用強(qiáng)。在mRNA水平上,高濃度(5、10μg/ml)時(shí),Ⅱ型fimA基因型P.gingivalis-LPS具有較強(qiáng)的刺激HUVEC表達(dá)TNF-αmRNA的作用。 提示3型P.gingivalis-LPS對(duì)HUVEC表達(dá)IL-1β、IL-6和TNF-α的調(diào)節(jié)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后兩個(gè)水平,從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂,可能在AS的進(jìn)程中起到關(guān)鍵的作用,且fimA基因型的差異可能導(dǎo)致Rgingivalis-LPS在調(diào)控HUVEC產(chǎn)生致炎細(xì)胞因子的能力存在差異。 (3)本實(shí)驗(yàn)研究條件下,應(yīng)用3型P.gingivalis-LPS刺激HUVEC后細(xì)胞表達(dá)IL-8蛋白水平和mRNA的水平升高,且存在著濃度依賴(lài)效應(yīng)。mRNA水平6h時(shí)達(dá)到高峰,蛋白水平24h時(shí)分泌量達(dá)到高峰。3型P.gingivalis-LPS間刺激HUVEC表達(dá)IL-8蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。6h時(shí),5μg/ml濃度Ⅱ型fimA基因型P.gingivalis-LPS較強(qiáng)刺激HUVEC表達(dá)IL-8mRNA的作用(p0.05)。 在3型P.gingivalis-LPS刺激下,HUVEC MCP-1的升高發(fā)生在轉(zhuǎn)錄mRNA水平和轉(zhuǎn)錄后蛋白水平,且存在著濃度依賴(lài)效應(yīng),mRNA水平在6h時(shí)達(dá)到高峰,24h時(shí)恢復(fù)到正常水平；蛋白水平在24h時(shí)達(dá)到高峰。Ⅰ型fimA基因型P.gingivalis-LPS刺激HUVEC MCP-1的蛋白表達(dá)強(qiáng)于Ⅱ型fimA基因型P.gingivalis-LPS。 提示P.gingivalis-LPS誘導(dǎo)HUVEC產(chǎn)生趨化因子的作用可能在AS進(jìn)程中發(fā)揮作用。fimA基因型的差異可能導(dǎo)致P.gingivalis-LPS誘導(dǎo)HUVEC表達(dá)MCP.1的能力存在著差異。 (4)本實(shí)驗(yàn)研究條件下,P.gingivalis-LPS刺激HUVEC后表達(dá)VCAM-1 mRNA與陰性對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)；在6h時(shí),較高濃度的(5、10μg/ml)Ⅰ型和Ⅱ型fimA基因型P.gingivalis-LPS刺激HUVEC表達(dá)ICAM-1 mRNA表達(dá)增加,Ⅱ型fimA基因型P.gingivalis-LPS這種上調(diào)作用強(qiáng)于Ⅰ型和Ⅳ型fimA P.gingivalis-LPS;但在蛋白水平上,本實(shí)驗(yàn)條件下未能檢測(cè)到VCAM-1和ICAM-1蛋白水平的升高。 提示較高濃度下,P.gingivalis-LPS可刺激HUVEC表達(dá)ICAM-1mRNA的水平上調(diào),P.gingivalis-LPS對(duì)HUVEC產(chǎn)生VCAM-1mRNA的作用不明顯。 結(jié)論：3型P.gingivalis-LPS均能刺激HUVEC表達(dá)致炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α,趨化因子IL-8和MCP-1,而且使黏附分子ICAM-1mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高。不同fimA基因型P.gingivalis-LPS對(duì)HUVEC功能的影響存在著差異。提示P.gingivalis感染可引起內(nèi)皮細(xì)胞活化和功能紊亂,從而引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng),可能在AS的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
【圖文】：

3.4賞試驗(yàn)結(jié)果:表1一1不同刀邢A基因型尸g功givalis一LPS及E.coll一LPS邀試驗(yàn)結(jié)果分組(Lps濃度n創(chuàng)ml)100502520151052I型盧川月p羅n羅valis-LPs++十++一一一一n型刀腳月尸gin鄉(xiāng)va沁一LPS+++++一一一一W型萬(wàn)用月p夢(mèng)呼valis一LPs+++++一一一一E.coli一LPS+++++一一一一陰性對(duì)照為等量的無(wú)熱源性水，結(jié)果均為陰性討論LPS是革蘭陰性厭氧菌細(xì)胞壁的主要成分，是重要的毒力因子。LPS被認(rèn)為pgingivall’s眾多致病因子中最重要的毒力因子之一[23l。研究表明pgingivalis一LP

10協(xié)ISYBR⑧尸爬m(xù)撫ExTa護(hù)M(內(nèi)含兀話故尺aExTa叮⑧HS，dNTpMixture，M擴(kuò)+，SYoreenl等)、l林l一o娜oFL上游引物、l川10卿01幾下游引物、2林1cDNA模板、ddHZO。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性305，，40個(gè)循環(huán)(95℃變性5s、退火溫度見(jiàn)相應(yīng)的退火溫度305、延伸75℃305)。將PCR儀的熒光采集時(shí)間統(tǒng)一設(shè)定在擴(kuò)增反延伸期。40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增結(jié)束后，系統(tǒng)將采集每一循環(huán)反應(yīng)時(shí)的各反應(yīng)管的熒度增長(zhǎng)指數(shù)進(jìn)行分析并繪制每一反應(yīng)管的擴(kuò)增動(dòng)力曲線。根據(jù)擴(kuò)增動(dòng)力曲線確定樣本品管中熒光強(qiáng)度增加到某一特定閩值是的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(CT值)，根據(jù)CT值準(zhǔn)模板初始拷貝的對(duì)數(shù)值作圖，得到該樣本的待測(cè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。(9)作用后HUvEC中IL一lp、IL一6、TNF一a目的基因相對(duì)拷貝數(shù)的測(cè)定:將逆轉(zhuǎn)錄得到的樣本的cDNA取2川，加入上述反應(yīng)體系，相同的反應(yīng)條件行PCR擴(kuò)增。收集數(shù)據(jù)，繪制動(dòng)力學(xué)曲線，測(cè)定各樣品的CT值與標(biāo)準(zhǔn)線進(jìn)行比與內(nèi)參基因的CT值加以校正。下下I一
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R781.4

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 崔平平;牙齦卟啉單胞菌上清液對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌炎性因子的影響[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2011年

本文編號(hào)：2660908