發(fā)布時間：2020-05-09 21:47

【摘要】：口腔鱗癌是口腔部位及周邊最為常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率占到口腔部位腫瘤總發(fā)病率的80%以上,是值得引起人們高度關(guān)注和重視的惡性疾病之一。雖然在歐美等發(fā)達(dá)國家口腔鱗癌的發(fā)病率有所下降,但在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率仍然呈現(xiàn)上升趨勢。近年來隨著醫(yī)療水平的不斷提高,許多惡性腫瘤的治療方面取得了不小的進(jìn)步,通過治療提高了患者的5年生存率。但在口腔鱗癌的治療方面,由于此疾病的發(fā)生早期不易被患者察覺等特殊性,致使該疾病的治療滯后,癌癥晚期的治療難度加大。因而有必要加大對口腔鱗癌治療的關(guān)注度,尋找出口腔鱗癌的更好的治療方法。 口腔鱗癌的治療方面,常規(guī)的治療方法包括手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、免疫治療等。這些治療方法雖然在一定程度上會抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展,但又存在較大的治療弊端。例如放療、化療會不可避免的引起嚴(yán)重副反應(yīng)而手術(shù)治療存在操作不易進(jìn)行等特點,單純手術(shù)治療無法根治腫瘤等方面的缺陷。免疫治療的療效并不明顯。而基因治療和分子靶向治療為近年來新興的腫瘤治療手段,由于其副反應(yīng)小、療效確切等方面的優(yōu)勢得到了科研工作者的青睞�；蛑委熤械腞NA干涉技術(shù)為近年來新興的疾病診療技術(shù),找到疾病致病的相關(guān)靶基因,對其進(jìn)行干預(yù)可有效的阻止疾病的進(jìn)程,尤其在腫瘤治療中越來越多的引起人們的關(guān)注。 STAT3基因為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活化因子3的編碼基因,其常被視為原癌基因。STAT3信號傳導(dǎo)通路的下游通路可影響許多推進(jìn)腫瘤進(jìn)程的相關(guān)因子的表達(dá),諸如cyclinD1、Bcl-xl、survivin、c-myc等因子。此外STAT3還參與了腫瘤的免疫逃逸過程,因而將STAT3基因作為腫瘤基因治療的靶點,對其進(jìn)行相應(yīng)的干預(yù),可成為腫瘤治療的有效手段。 本研究正是利用了基因治療中的RNA干涉療法,將腫瘤相關(guān)的癌基因STAT3作為治療靶點,設(shè)計了針對STAT3基因位點的RNAi質(zhì)粒,將質(zhì)粒導(dǎo)入口腔鱗癌細(xì)胞,首先在體外觀察該質(zhì)粒的RNA干涉效應(yīng)對口腔鱗癌進(jìn)程的影響,之后利用口腔鱗癌動物模型進(jìn)行相關(guān)的動物體內(nèi)實驗,驗證RNAi對STAT3基因進(jìn)行干預(yù)后所產(chǎn)生的腫瘤抑制效果。 本研究對口腔鱗癌的治療方法進(jìn)行了全新的探索,有望通過本研究開辟出口腔鱗癌治療的新途徑。 目的: 探討通過RNA干涉技術(shù)對STAT3基因進(jìn)行敲除對口腔鱗癌細(xì)胞造成的體外抑制以及對口腔鱗癌動物模型的抑瘤效果。 方法: (1)應(yīng)用免疫組化方法檢測正常口腔黏膜組織、不典型增生組織及口腔鱗癌組織中STAT3、EGF及EGFR蛋白的表達(dá)。 (2)應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建出STAT3基因的干擾質(zhì)粒,即psilencer1.0- U6-stat3-siRNA質(zhì)粒。 (3)應(yīng)用基因工程下游技術(shù),諸如Western blot、RT-PCR、免疫組化等方法在體外和體內(nèi)對不同實驗分組的口腔鱗癌腫瘤細(xì)胞的STAT3 mRNA表達(dá)水平及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測,判斷RNAi的抑瘤效果。 (4)體外實驗:針對RNAi的干擾位點設(shè)計STAT3的siRNA模板,在體外成功設(shè)計并合成出該模板,對質(zhì)粒載體進(jìn)行酶切,使其線性化并進(jìn)行回收。之后對樣本進(jìn)行核算定量。利用T4連接酶將線性質(zhì)粒載體同干擾片段進(jìn)行連接。之后進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞的制備,再將重組質(zhì)粒同感受態(tài)細(xì)胞共同孵育,進(jìn)行質(zhì)粒對感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。要進(jìn)行重組質(zhì)粒的提取與鑒定。之后進(jìn)行重組質(zhì)粒對細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染要按照如下的方式進(jìn)行實驗分組,實驗分為四組,包括陽性重組質(zhì)粒實驗組;陰性重組質(zhì)粒對照組;空白質(zhì)粒對照組;空白溶劑對照組。實驗分組的相應(yīng)實驗完成后,進(jìn)行相關(guān)體外實驗對各組STAT3相關(guān)蛋白表達(dá)的抑制情況進(jìn)行檢測。制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,經(jīng)過蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移,封閉,抗體的結(jié)合,顯色照相等步驟完成免疫印跡實驗;對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA進(jìn)行提取,經(jīng)RNA定量,cDNA的獲取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),引物合成,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),PCR產(chǎn)物的檢測等步驟對STAT3 mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行檢測;利用流式細(xì)胞儀對實驗細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測;配置比色試劑,對細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶的酶解,進(jìn)行顯色、比色等步驟對細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行MTT法的相關(guān)檢測。 (5)體內(nèi)實驗:將人Tca8113舌鱗癌細(xì)胞重懸培養(yǎng)后對裸鼠進(jìn)行背部的接種,建立人舌鱗癌的裸鼠動物模型,待腫瘤體積增長到50mm3后模型建立成功。之后利用電轉(zhuǎn)染的方法將psilencer1.0-U6-stat3-siRNA重組質(zhì)粒及空白質(zhì)粒、對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)入腫瘤組織的癌細(xì)胞內(nèi)。定期對腫瘤的生長情況進(jìn)行檢測,定期檢測各組裸鼠腫瘤體積的增長速度并在實驗結(jié)束后取下腫瘤,對腫瘤的重量進(jìn)行測定。利用RT-PCR方法檢測STAT3基因的mRNA表達(dá)情況,利用western blot方法檢測STAT3及其相關(guān)基因MMP2、VEGF的蛋白表達(dá)情況,利用免疫組化方法檢測STAT3及其相關(guān)基因BAX、BCL-2的表達(dá)情況。 結(jié)果: (1)免疫組化研究結(jié)果顯示:口腔鱗癌癌變過程中STAT3蛋白表達(dá)在正常黏膜組織、不典型增生組織及癌組織中的表達(dá)率依次增高,分別為13.3%(8/60)、30.0%(9/30)、71.2%(43/60)組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);而EGF蛋白在正�？谇火つそM織、不典型增生組織及口腔鱗癌組織中的表達(dá)率分別為25.0%(15/60)、46.7%(14/30)、76.7%(46/60),組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);EGFR在正常黏膜組織、不典型增生組織及癌組織中的表達(dá)率分別為15.0%(9/60)、36.7%(11/30)、70.0%(42/60),組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),三者呈正相關(guān)關(guān)系�？谇击[癌組織中STAT3蛋白表達(dá)與癌的組織學(xué)分級、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P0.05); EGF及EGFR蛋白表達(dá)均與癌的組織浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P0.05)。 (2)經(jīng)相關(guān)的酶切檢定,檢測出了psilencer1.0-U6-stat3-siRNA質(zhì)粒構(gòu)建成功。 (3)體外實驗的實驗結(jié)果:研究結(jié)果表明,實驗組重組質(zhì)粒對舌鱗癌細(xì)胞具備較強的促細(xì)胞凋亡和增殖抑制作用;Western blot的實驗結(jié)果和逆轉(zhuǎn)錄PCR的實驗結(jié)果均顯示重組質(zhì)粒對細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制效果,對細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生促進(jìn)效果,為了驗證重組質(zhì)粒的促凋亡、抑制增殖的分子機制,特進(jìn)行了MTT實驗和流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期實驗。MTT實驗的結(jié)果顯示重組質(zhì)粒可明顯的抑制細(xì)胞的增殖,而流式細(xì)胞儀實驗則顯示重組質(zhì)粒將細(xì)胞周期阻斷在G0/G1分期,在正常2倍體峰之前出現(xiàn)了亞二倍體峰,具備較高的凋亡率。 (4)體內(nèi)實驗的實驗結(jié)果:成功的構(gòu)建出口腔鱗癌裸鼠皮下移植瘤動物模型,實驗組動物的腫瘤體積增長速度明顯小于其他對照組腫瘤體積的生長速度(p0.05)。實驗組動物腫瘤的最終體積要明顯小于各對照組動物腫瘤的最終體積(P0.05)。RT-PCR檢測STAT3基因mRNA的表達(dá)情況顯示實驗組的STAT3 mRNA的表達(dá)水平要明顯高于對照組(P0.05),western blot方法檢測STAT3及其相關(guān)基因MMP2、VEGF的蛋白表達(dá)情況顯示實驗組的蛋白表達(dá)量要明顯的低于對照組(P0.05),免疫組化方法檢測STAT3及其相關(guān)基因BAX、BCL-2的表達(dá)情況顯示實驗組的相關(guān)蛋白表達(dá)量要明顯低于對照組(P0.05)。 結(jié)論: (1)STAT3、EGF及EGFR在口腔鱗癌的浸潤、轉(zhuǎn)移及粘膜上皮癌變過程中起著重要作用,提示聯(lián)合檢測STAT3、EGF及EGFR可望成為口腔鱗癌早期診斷和判斷預(yù)后的客觀指標(biāo)之一。 (2)涉及STAT3的siRNA基因阻斷質(zhì)粒,成功進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,可有效的抑制口腔鱗癌細(xì)胞中STAT3信號傳導(dǎo)通路的激活和信息傳遞。信號傳導(dǎo)通路的抑制又使腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期被阻斷,誘導(dǎo)口腔鱗癌細(xì)胞的體外凋亡。該結(jié)論提示可將STAT3 siRNA作為口腔鱗癌的治療分子。 (3)體內(nèi)實驗的實驗結(jié)果表明,成功的轉(zhuǎn)染STAT3 siRNA質(zhì)粒進(jìn)入實驗?zāi)Ｐ偷哪[瘤部位后可有效的抑制腫瘤體積的增長。對STAT3基因表達(dá)的抑制可致使該信號通路下游的MMP-2及VEGF分子的表達(dá)被抑制,這提示對STAT3信號通路抑制,可間接抑制MMP-2、VEGF等腫瘤相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。
【圖文】：

分[強陽性（+++）]細(xì)胞漿內(nèi)可見大量的深紫藍(lán)色1）的評分×項目（2）的評分。其中，陰性為＜用 SPSS11.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理，以 α=0.05 為驗來檢測樣本率，Spearman 分析軟件來分析相表達(dá)及其與口腔鱗癌臨床生物學(xué)行為的關(guān)系性表達(dá)主要位于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，部分陽性細(xì)(見圖1)。在口腔鱗癌中表達(dá)率為71.2%；在不典型分別為30.0%，，13.3%）。三者比較有統(tǒng)計學(xué)意義（白表達(dá)與口腔鱗癌患者組織學(xué)分級、浸潤深度、989，5.602，P <0.05）（表2）。

圖 2 EGF 蛋白在鱗癌組織中的表達(dá)（SP×400）表達(dá)及其與口腔鱗癌臨床生物學(xué)的行為的關(guān)系性部位定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色或深黃色（見在不典型增生和正�？谇火つぶ械谋磉_(dá)降低（分計學(xué)意義（P<0.05）（表 1）。EGFR 蛋白表達(dá)在口統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），EGFR 蛋白表達(dá)與口腔鱗移有關(guān)（χ2分別為33.112，14.557，2.824，P<0
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R739.8

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本文編號：2656787