【摘要】： 正畸牙齒移動的生物學(xué)基礎(chǔ)是牙周組織主導(dǎo)的骨吸收和骨形成活動。牙周膜細胞是正畸力的直接效應(yīng)細胞,是一組有異質(zhì)性的細胞群,其中的一些細胞可以分化為成骨細胞和成牙骨質(zhì)細胞,同時牙周膜成纖維細胞還可以通過表達骨保護因子(osteoprotegerin,OPG)和破骨細胞分化因子(receptor activatornuclear factor kappa B ligand,RANKL)來調(diào)節(jié)破骨細胞的活動。成骨/基質(zhì)細胞與前體破骨細胞(osteoclast precursors,OCP)的直接接觸是破骨細胞(osteoclast,OC)形成、分化過程中必不可少的因素之一,而且骨吸收刺激因子作用于成骨/基質(zhì)細胞后,其產(chǎn)生RANKL與前體破骨細胞及破骨細胞膜上表達的RANKL受體(receptor activator of nuclear factor-κB receptor,RANK)結(jié)合,引起級聯(lián)反應(yīng),使破骨細胞分化、成熟、激活,并促進其從骨膜釋放、轉(zhuǎn)移、粘附到骨質(zhì)表面。除了RANKL,成骨/基質(zhì)細胞還生成與之對應(yīng)的OPG,可競爭性地與RANK結(jié)合,以封閉RANKL與RANK的結(jié)合,抑制破骨細胞的分化成熟,抑制骨吸收功能。 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族,是誘導(dǎo)成骨活性最強的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)之一,可促進牙槽骨、牙骨質(zhì)和牙周韌帶的再生。國外學(xué)者研究認為,BMP-2具有誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)破骨細胞分化和活化骨吸收功能的作用,并且通過RANKL/OPG途徑誘導(dǎo)成骨/基質(zhì)細胞參與破骨細胞的活化,但是國內(nèi)關(guān)于BMP-2對人牙周膜成纖維細胞參與的破骨細胞活化的影響尚未見報道。 牙周膜細胞是正畸施力后的主要效應(yīng)細胞,在壓力和張力的作用下,牙槽骨同時開始骨吸收和骨形成的骨改建過程,BMP-2同時具有成骨和誘導(dǎo)破骨細胞分化的作用,明確其對牙周膜細胞的作用對于了解正畸牙齒的移動速度、矯治的效率、牙槽骨的改建以及矯治結(jié)束后的穩(wěn)定性均有重要意義。 本實驗在體外將分離培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細胞(human periodontalligament fibroblasts,PDLFs)和從人全血中分離出的單個核細胞(Peripheral BloodMononuclear Cells,PBMCs)進行直接共培養(yǎng),探討重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(recombinant human BMP-2,rhBMP-2)和人牙周膜成纖維細胞在破骨樣細胞形成中的作用;探索體外分離培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細胞OPG和RANKL的表達,并探討rhBMP-2對其表達的影響。本研究將實驗分為以下兩部分: 一、rhBMP-2和人牙周膜成纖維細胞對體外誘導(dǎo)破骨樣細胞生成的影響 目的 (1)建立人牙周膜成纖維細胞和人外周血中單個核細胞的直接共培養(yǎng)模型,觀察人牙周膜成纖維細胞在破骨樣細胞誘導(dǎo)形成過程中的作用; (2)觀察rhBMP-2對TRAP(tartrate-resistant acidic phosphatase)陽性單個核細胞和TRAP陽性多核破骨樣細胞形成的影響; (3)探討rhBMP-2和人牙周膜成纖維細胞對破骨樣細胞誘導(dǎo)形成的影響及其可能的作用機制。 方法 組織塊法體外常規(guī)培養(yǎng)人牙周膜成纖維細胞,同時利用Ficoll-Paque Plus淋巴分離液分離人外周血單個核細胞。在含有1×10~8mol/L 1α,25-(OH)_2D_3與1×10~(-7)mol/L地塞米松的培養(yǎng)液中,將單個核細胞進行單獨培養(yǎng)或與牙周膜成纖維細胞直接共培養(yǎng)18天,同時設(shè)置rhBMP-2(+)和rhBMP-2(-)組,以后每3天進行換液,每次半換液,觀察TRAP陽性單個核細胞和TRAP陽性多核破骨樣細胞的數(shù)量,并且分析rhBMP-2和人牙周膜成纖維細胞對其影響。 結(jié)果 (1)通過TRAP染色法和牙本質(zhì)上的骨吸收陷窩證明了人牙周膜成纖維細胞和外周血單個核細胞直接共培養(yǎng)誘導(dǎo)破骨樣細胞的模型是可行的; (2)共培養(yǎng)體系中,rhBMP-2(+)組與rhBMP-2(-)組的TRAP陽性多核細胞數(shù)目相比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=71.070,P＜0.001);共培養(yǎng)組與單個核細胞組之間的TRAP陽性多核細胞數(shù)目相比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=39.000,P＜0.001);共培養(yǎng)組受rhBMP-2誘導(dǎo)后,TRAP陽性多核細胞數(shù)目顯著增加(t=17.079,P＜0.001); (3)rhBMP-2與人牙周膜成纖維細胞在TRAP陽性多核細胞的形成中發(fā)揮重要作用;同時,rhBMP-2與人牙周膜成纖維細胞聯(lián)合作用能促進TRAP陽性多核細胞的生成。 結(jié)論: (1)在與人牙周膜成纖維細胞直接共培養(yǎng)的前提下,人外周血單個核細胞可分化為TRAP陽性的破骨樣細胞; (2)rhBMP-2有促進破骨樣細胞生成的作用,其作用機制可能是通過人牙周膜成纖維細胞間接作用于人外周血單個核細胞。 二、人牙周膜成纖維細胞OPG和RANKL的表達以及rhBMP-2對其表達的影響 目的 (1)檢測人牙周膜成纖維細胞OPG和RANKL在基因水平和蛋白水平的表達; (2)觀察rhBMP-2對人牙周膜成纖維細胞中OPG和RANKL蛋白表達的影響,從而探討rhBMP-2對破骨樣細胞生成的作用機制。 方法 采用組織塊法體外培養(yǎng)人牙周膜成纖維細胞,選取生長狀態(tài)較好的細胞,利用免疫細胞化學(xué)檢測正�；A(chǔ)狀態(tài)下,人牙周膜成纖維細胞上RANKL蛋白的表達,以酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測OPG蛋白的表達。然后利用100ng/mlrhBMP-2對人牙周膜成纖維細胞進行誘導(dǎo),分別于誘導(dǎo)3d、6d、9d、12d、15d、18d時收集細胞培養(yǎng)液上清,檢測分泌型OPG蛋白表達的變化。 結(jié)果 (1)人牙周膜成纖維細胞膜上和胞漿中表達RANKL蛋白,符合其跨膜蛋白的特征;同時也分泌OPG蛋白到培養(yǎng)液中; (2)在18天的誘導(dǎo)周期中,雖然OPG蛋白的分泌量由于細胞增殖呈升高趨勢,但rhBMP-2(+)組的增長趨勢低于rhBMP-2(-),說明rhBMP-2的誘導(dǎo)可顯著減少OPG蛋白的分泌(F=45.433,P＜0.001)。 結(jié)論: (1)在正常的基礎(chǔ)狀態(tài)下,人牙周膜成纖維細胞能可表達OPG和RANKL; (2)rhBMP-2的誘導(dǎo)影響OPG蛋白的表達,推測其可能通過OPG/RANKL通路來影響人牙周膜成纖維細胞參與的破骨樣細胞的活化。
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1.2.1人牙周膜成纖維細胞形態(tài)學(xué)觀察及鑒定倒置相差顯微鏡下觀察:組織塊接種5~8d后，可見有細胞從組織塊旁游離出來，呈典型細長梭形、短梭形或三角形等(圖1一1所示)。接種20d后細胞爬滿瓶底(圖1一2所示)。圖1一1人牙周膜成纖維細胞原代培養(yǎng)5d，細胞開始游離出來舊ar=loo阿)F論1一卜P面山叼H.叮anPDLFscu】加葉刃forsdays，theeelhbegangrowing毋。100阿)

(B護100林m)人牙周膜成纖維細胞的免疫組化鑒定:人牙周膜成纖維細胞波形絲蛋白染色陽性(細胞胞漿棕黃色)，，角蛋白陰性，說明所培養(yǎng)的細胞來源于中胚層(圖1一3和1一所示)。偽、\·、，的嗽認找飛一‘“了廠萬‘爭‘..卜/‘r夕-卜.日于八了/圖l一3人牙周膜成纖維細胞波形絲蛋白染色陽性，細胞漿呈棕黃色(B二100卿)Figl一 3:ThePositiveexPn污 sionofvimentininHumanPDLFs(B二100冬田1)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R783.5

【參考文獻】

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本文編號：2655881