【摘要】： 成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和牙本質(zhì)形成的機(jī)制至今尚未完全明確。隨著對(duì)牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體研究的逐步深入，對(duì)成牙本質(zhì)細(xì)胞的需求已極為廣泛，，但由于天然成牙本質(zhì)細(xì)胞數(shù)量有限，獲取足夠量的純化的成牙本質(zhì)細(xì)胞尚難以實(shí)現(xiàn)。因此，建立穩(wěn)定的、克隆化的、具有成牙本質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)表型和功能的細(xì)胞系已成為急需。然而，人牙乳頭組織來源的牙乳頭外胚間充質(zhì)細(xì)胞和(或)成牙本質(zhì)細(xì)胞在通常的體外培養(yǎng)條件下經(jīng)過十余次的傳代后，就會(huì)停止分裂增殖，發(fā)生衰老和死亡。有學(xué)者在培養(yǎng)原代成牙本質(zhì)細(xì)胞和／或牙乳頭細(xì)胞的基礎(chǔ)上，誘導(dǎo)其自發(fā)性永生化或轉(zhuǎn)染永生化基因(如sV40大T抗原和HPV18 E6／E7等DNA腫瘤病毒)，建立了永生化的小鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞系和牛成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞系，如MDPC-23、M06-G3，但僅具有成牙本質(zhì)細(xì)胞的部分特征。同時(shí)，它們是腫瘤病毒誘導(dǎo)的永生化細(xì)胞系，有許多局限性：外源性基因的整合是隨機(jī)的，其表達(dá)產(chǎn)物可干擾細(xì)胞內(nèi)生理途徑而發(fā)生非預(yù)期的改變；轉(zhuǎn)染獲得的是轉(zhuǎn)化細(xì)胞而非正常細(xì)胞，其表型、核型等可發(fā)生改變；并非所有的細(xì)胞系都是“無限增殖”，有的僅渡過了衰老期(senescence，M1期)而延長(zhǎng)了細(xì)胞壽命。 為了克服現(xiàn)有細(xì)胞系的缺點(diǎn)，本研究將人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因轉(zhuǎn)染至原代人成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，激活端粒酶，細(xì)胞逾越M1期和危機(jī)期(crisis，M2期)而發(fā)生永生化，成功建立起永生化細(xì)胞系。由于hTERT激活端粒酶誘導(dǎo)細(xì)胞永生化的過程類似胚胎干細(xì)胞內(nèi)存在的生理途徑，故該永生化細(xì)胞系保留了更多的人成牙本質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)特征和功能學(xué)特征。主要進(jìn)行了如下幾方面的研究： 一、人成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的原代培養(yǎng) 取8月齡合法引產(chǎn)胎兒，剝離乳磨牙胚牙乳頭，組織塊法培養(yǎng)。原代細(xì)胞作平板克隆，礦化液培養(yǎng)10天后，濾紙片法挑取了3個(gè)與成牙本質(zhì)細(xì) 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 胞形態(tài)相似的細(xì)胞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)。其中克隆a來源的細(xì)胞呈梭形、未見 核極化，部分具有單側(cè)較長(zhǎng)細(xì)胞突起。同時(shí)它們?cè)贗nRNA的水平上表達(dá)牙本 質(zhì)基質(zhì)蛋白 1（denim matrix protein，DMPI）和牙本質(zhì)涎磷蛋白 （dent。n slalonhosnhonrotein，DSPP），具有較高堿性磷酸酶 （alkaline PhosPhatase，ALP）活性，在礦化液誘導(dǎo)下形成細(xì)胞結(jié)節(jié)并礦 化。因此，該培養(yǎng)細(xì)胞為人成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，為下一步的研究奠定了 基礎(chǔ)。 二、永生化人成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞系的建立 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將編碼 hTERT 和 neo 基因的真核表達(dá)質(zhì)粒 pCIneo－h(huán)TERT導(dǎo)入原代培養(yǎng)的人成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。培養(yǎng)液加 G4lS篩 選約一個(gè)月后，抗性細(xì)胞克隆形成，濾紙片法轉(zhuǎn)移、擴(kuò)增，共獲得5個(gè)細(xì) 胞克隆。hTERT穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，表達(dá)mRNA及其蛋白質(zhì)，同時(shí)細(xì)胞端粒酶 活性轉(zhuǎn)為陽性�？寺b來源的細(xì)胞在體外長(zhǎng)期連續(xù)培養(yǎng)下生長(zhǎng)良好，至今 傳代達(dá)56代，約6個(gè)月，命名為hTERT介導(dǎo)的永生化人成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì) 胞系（hTERT－immortalized odontoblast－like cell line，hTERT－h(huán)od－ 工）。 三、永生化人成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞系的生物學(xué)特征 體外連續(xù)培養(yǎng)過程中，hTERT－h(huán)odl 呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，細(xì)胞器 發(fā)達(dá)，生長(zhǎng)增殖活躍，具有克隆形成能力。同時(shí)，細(xì)胞核型正常，無裸鼠 致瘤性，在軟瓊脂內(nèi)不能生長(zhǎng)，血清依賴性無顯著降低，仍具有接觸抑制 性�？傊琱TERT－h(huán)od－1基本上為正常細(xì)胞而無明顯轉(zhuǎn)化特征，保持了人 成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的生物學(xué)特征。 四、永生化人成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞系的功能學(xué)特征 hTEBT－h(huán)od－1 在 mRNA水平上表達(dá)骨涎蛋白（bone sialoproteln， BSP）、DMPI 和 DSPP，在蛋白質(zhì)水平上表達(dá) 1 型膠原和牙本質(zhì)涎蛋白 （denim sialoprotein，DSP）。在礦化液誘導(dǎo)下，細(xì)胞 ALP活性升高， 骨鈣素（osteocalcin，OC）分泌量增加，細(xì)胞復(fù)層生長(zhǎng)而形成細(xì)胞結(jié)節(jié)， －4． 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 分泌基質(zhì)并礦化。透射電子顯微鏡觀察顯示：細(xì)胞蛋白質(zhì)合成分泌功能活 躍，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）見大量網(wǎng)狀或平行排列的 膠原（原）纖維和高電子密度的針狀晶體沉積。細(xì)胞內(nèi)和ECM中可見基質(zhì) 膜泡。因此，hTERT－h(huán)odl在體外培養(yǎng)中可以分泌牙本質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)并礦 化。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R780.2

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 何文喜,牛忠英,趙守亮,臧曉霞,高杰;成牙本質(zhì)細(xì)胞系MDPC-23的生物學(xué)特性[J];口腔醫(yī)學(xué)研究;2004年02期

2 王捍國(guó),肖明振,趙守亮,郝建軍,郝玉慶;永生化人成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞系體外礦化的初步觀察[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2004年11期

本文編號(hào)：2648327