【摘要】：目的:研究β1腎上腺素能受體(β1-AR)及β2腎上腺素能受體(β2-AR)在CD133~+口腔鱗狀細胞癌(OSCC)干細胞、OSCC細胞系Cal-27、SAS、SCC-9及正�？谇火つぜ毎械谋磉_;研究阻滯β2-AR對CD133~+OSCC干細胞與OSCC細胞系增殖、遷移及侵襲的影響;以基因高通量測序篩選β2-AR被阻滯及β2-AR未被阻滯的CD133~+OSCC干細胞的差異表達基因,從基因轉錄組層面和基因表達方向探究β2-AR與OSCC腫瘤干細胞在口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的作用。方法:應用胰蛋白酶消化的方法對正�？谇火つさ镊[狀上皮細胞進行原代細胞培養(yǎng)。同時應用實時熒光定量PCR及Western Blot技術測定β1-AR與β2-AR在6例CD133~+OSCC干細胞、3例OSCC細胞系(Cal27、SAS及SCC9)及6例正�？谇火つど掀ぜ毎械谋磉_。應用Cell Counting Kit-8(CCK-8)實驗方法研究不同濃度的β2-AR特異阻滯劑ICI118,551對3例CD133~+OSCC干細胞和2例OSCC細胞系(SAS及SCC9)增殖的影響。然后以集落形成實驗檢測β2-AR特異阻滯劑ICI118,551對CD133~+OSCC干細胞單細胞增殖能力的影響。而后采用細胞劃痕實驗探究不同濃度的β2-AR特異阻滯劑ICI118,551對CD133~+OSCC干細胞和OSCC細胞系SCC9遷移的影響。再以Transwell實驗研究不同濃度的β2-AR特異阻滯劑ICI118,551對CD133~+OSCC干細胞和OSCC細胞系SCC9侵襲的影響。最終通過基因高通量測序技術構建β2-AR受到阻滯與未受到阻滯的CD133~+OSCC干細胞的差異表達基因譜,并應用Gene Ontology(GO)富集分析和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析對篩選得到的表達明顯差異的基因進行功能分析。結果:實時熒光定量PCR及Western Blot結果發(fā)現β1-AR與β2-AR在CD133~+OSCC干細胞組、OSCC細胞系(Cal27、SAS及SCC9)的表達均高于正�？谇火つど掀ぜ毎M。CCK-8實驗結果顯示CD133~+OSCC干細胞與SCC9、SAS在不同濃度的ICI118,551藥物作用48小時后,藥物濃度越高則細胞的存活率越低,0.1μM、0.5μM、1μM、2.5μM及5μM與0μM比較,各藥物濃度間的細胞存活率差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。集落形成實驗結果顯示加藥組3個孔集落數(個)分別為30、30及32,集落形成率(%)為61.33±2.31(n=3);對照組3個孔集落數(個)分別為34、35及37,集落形成率(%)為70.67±3.06(n=3),差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。細胞劃痕實驗結果示SCC9及CD133~+OSCC干細胞的遷移率隨藥物ICI118,551的濃度的上調而逐漸下降(P0.05);藥物濃度為0.1μM、0.5μM、1μM、2.5μM、5μM及7.5μM時SCC9及CD133~+OSCC干細胞的遷移率與藥物濃度為0μM時的遷移率比較具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Transwell實驗結果示SCC9及CD133~+OSCC干細胞的侵襲率隨藥物ICI118,551的濃度的上調而逐漸下降(P0.05);藥物濃度為0.1μM、0.5μM、1μM、2.5μM、5μM、7.5μM與10μM時SCC9及CD133~+OSCC干細胞的侵襲率與藥物濃度為0μM時的侵襲率比較具有統(tǒng)計學意義(P0.05)�；蚋咄繙y序在加藥組和對照組中篩選得到994個差異表達基因,其中用藥后有237個基因表達上調,757個基因表達下調。經GO分析,差異表達基因注釋到分子功能(Molecular Function,MF)的有118類,注釋到細胞組分(Cellular Component,CC)的有92類、注釋到生物學進程(Biological Process,BP)的有856類。KEGG分析結果顯示差異表達基因富集于細胞周期、MAPK信號通路、癌癥相關微小RNA、癌癥相關通路、PI3K-Akt信號通路與Ras信號通路等19條信號通路。結論:β1-AR及β2-AR在CD133~+OSCC干細胞、OSCC細胞系中的表達均顯著高于正�？谇火つぜ毎�。阻滯β2-AR可抑制CD133~+OSCC干細胞、OSCC細胞系的增殖、遷移及侵襲能力。阻滯β2-AR后,CD133~+OSCC干細胞發(fā)生顯著變化的基因主要富集于組織發(fā)育(tissue development)、細胞增殖(cell proliferation)、上皮細胞分化(epithelial cell differentiation)、細胞遷移(cell migration)及細胞運動(cell motility)等生物進程;并且這些差異表達的基因可能在一定程度上通過MAPK、PI3K/Akt與Ras等信號通路參與OSCC的發(fā)生與發(fā)展。
【圖文】：

圖3-1口腔正常黏膜上皮細胞的培養(yǎng)。5天后于4×10倍鏡下觀察(a),14天后于4×10倍鏡下觀察 (b),21天后于 4×10 倍鏡下觀察(c), 21 天后于 10×10 倍鏡下觀察(d)Figure.3-1 Culture of normal oral mucosal epithelial cells. Observation under 4 x 10-fold microscope after5 days (a); Observation under 4 x 10-fold microscope after 14 days (b); Observation under 4 x 10-foldmicroscope after 21 days (c) ; Observation under 10 x 10-fold microscope after 21 days (d).

腺素受體阻滯劑對口腔鱗狀細胞癌干細胞增殖遷移侵襲的作用機制研究 β1-AR 的 mRNA 在口腔鱗狀細胞癌 CD133+干細胞、口腔 Cal27、SCC9 及 SAS 和正�？谇火つど掀ぜ毎芯斜磉_量分別為 3.66±0.37、7.70±0.38、18.06±0.91、1.45±0.1 3-2，β1-AR 的 mRNA 在口腔鱗狀細胞癌 CD133+干細胞黏膜上皮細胞，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；β腔鱗狀細胞癌細胞系 Cal27 中的表達高于口腔黏膜上皮學意義（P＜0.001）；β1-AR 的 mRNA 在口腔鱗狀細胞表達高于口腔黏膜上皮細胞，，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜RNA 在口腔鱗狀細胞癌細胞系 SAS 中的表達高于口腔具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R739.8

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