【摘要】：目的以大鼠顳下頌髁突軟骨細胞為體外模型,用白細胞介素-1β模擬顳下頌關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎中的細胞環(huán)境,探究一氧化碳釋放分子-3對白細胞介素-1β誘導的軟骨細胞中Ⅱ型膠原及凋亡相關(guān)因子Bax/Bcl-2的影響和可能的機制。方法取3-4周齡,體重約為100克左右的Wistar大鼠,無菌條件下分離髁突軟骨(位于髁突頭部,呈乳白色),用0.25%胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶交替消化后進行大鼠髁突軟骨細胞的體外培養(yǎng),顯微鏡下觀察。取第二代細胞制作爬片,配置甲苯胺藍染色液,行細胞鑒定;取第三代細胞加藥處理,提取總RNA和總蛋白,具體條件為用白細胞介素-1β處理細胞24小時,濃度分別為0,1,5和1Ong/ml,收集細胞用于進一步分析。從基因和蛋白水平分別檢測各組細胞中Ⅱ型膠原及凋亡相關(guān)因子Bax/Bcl-2的表達變化,以此確定誘導髁突軟骨細胞的最佳白細胞介素-1β工作濃度;細胞分別用濃度為100,200,400μM的一氧化碳釋放分子-3(CORM-3)預處理24小時后,棄原培養(yǎng)基,換用1Ong/ml白細胞介素-1β處理,24小時后使用CCK-8測定法檢測細胞的活力,提取總RNA,進行實時定量聚合酶鏈反應(yīng),檢測相關(guān)基因Ⅱ型膠原和Bax/Bcl-2的表達,以此確定后面實驗最佳的一氧化碳釋放分子-3工作濃度;接著將活性較好的軟骨細胞用200μMCORM-3和degassed CORM-3(提前24小時配置并釋放完一氧化碳氣體)預處理,24小時后換用10ng/ml白細胞介素-1β刺激。收集細胞并取適量懸液,應(yīng)用凋亡試劑盒后上機檢測凋亡情況,提取總蛋白,用蛋白印記法檢測相關(guān)蛋白Ⅱ型膠原和Bax/Bcl-2的表達;為了探究可能的機制,取上述總蛋白用蛋白印跡法檢測各組中血紅素加氧酶-1的表達情況。結(jié)果①鏡下觀察分離后的軟骨細胞貼壁后呈多角形,培養(yǎng)7-8天后達到匯合狀態(tài),似“鋪路石”狀。傳代后細胞較原代分布均勻,增殖速率加快,細胞狀態(tài)良好。第四代以后的細胞呈不規(guī)則生長,部分細胞似有觸角伸出,形狀由多角形轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形,生長速率明顯變慢;鏡下觀察染色后的細胞,多數(shù)胞核為圓形,呈深藍色,胞質(zhì)呈淡藍色,細胞間有大量深藍色的顆粒狀物質(zhì),為分泌到細胞外基質(zhì)的蛋白聚糖。②髁突軟骨細胞中Bax mRNA和蛋白的表達隨著IL-1 β濃度的升高而增加,Bcl-2以及細胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原mRNA和蛋白的表達隨著IL-1β濃度的升高而降低,且都呈劑量依賴性,根據(jù)實驗結(jié)果,選擇1Ong/ml作為后續(xù)實驗的IL-1β工作濃度。③用濃度為100,200,400μM的CORM-3預處理細胞后,與IL-1β刺激組比較,髁突軟骨細胞存活率明顯提高,細胞中Bax mRNA的表達顯著降低,Bcl-2和Ⅱ型膠原mRNA的表達明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義,且20μM CORM-3預處理組作用效果最顯著,200μM可作為后續(xù)實驗的最佳工作濃度。④流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,IL-1β+200μM CORM-3預處理組細胞凋亡率明顯低于IL-1β刺激組,CORM-3對細胞凋亡的影響是由其釋放的CO介導的,degassed CORM-3預處理組不能抑制細胞凋亡,其凋亡率與IL-1β刺激組比較無明顯差異;degassed CORM-3預處理后消除了正常CORM-3對IL-1 β刺激的細胞中Bax,Bcl-2和Ⅱ型膠原表達的調(diào)節(jié)作用;⑤degassed CORM-3預處理組細胞中HO-1蛋白表達與IL-1β刺激組相比無顯著差異,而200μM CORM-3預處理組細胞中HO-1蛋白表達較IL-1β刺激組和degassed CORM-3預處理組顯著增加。結(jié)論一氧化碳釋放分子-3可抑制白細胞介素-1β誘導的大鼠髁突軟骨細胞凋亡,促進細胞中Bcl-2及Ⅱ型膠原的表達同時減少Bax的產(chǎn)生;可能的機制為一氧化碳釋放分子-3激活血紅素加氧酶-1蛋白來發(fā)揮其抗凋亡的作用。
【圖文】：

原代髁突軟骨細胞（７邋ｄａｙｓ邋４0ｘ）邐原代髁突軟骨細胞（７邋ｄａｙｓ邋１０0ｘ）逡逑圖１－１大鼠髁突軟骨細胞的體外培養(yǎng)逡逑ｖ邐，逡逑ｇ邋．逡逑’邋．ｓ邋二邋■逡逑ｒ邐各？％：邐：邐Ｖ邋‘邋１０0Ｘ邐２００Ｘ逡逑Ｅ邐Ｆ逡逑圖１－２大鼠髁突軟骨細胞甲苯胺藍染

圖１－１大鼠髁突軟骨細胞的體外培養(yǎng)逡逑ｖ邐，，逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R782.6

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本文編號：2602960