本文關鍵詞：多被銀蓮花總皂甙誘導人涎腺腺樣囊性癌高肺轉移細胞凋亡過程中Bcl-2和Bax蛋白的表達及意義，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)是最常見的涎腺惡性腫瘤之一。因其浸潤性強和易發(fā)生遠處轉移而嚴重危害人類健康,因此探索新的預防治療方法,提高對涎腺腺樣囊性癌的療效,是廣大學者研究的熱點問題。多被銀蓮花(Anemone Raddeana Regel)是毛茛科銀蓮花屬植物的根莖。藥理活性研究發(fā)現,多被銀蓮花提取物有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜及抗驚厥作用。我們前期的實驗結果表明,多被銀蓮花總皂甙能夠抑制人涎腺腺樣囊性癌高肺轉移細胞(Adenoid cystic carcinoma of high pulmonary metastatic,ACC-M)的增殖,并能夠誘導其凋亡。目前Bcl-2家族成員Bcl-2及Bax蛋白在多被銀蓮花總皂甙誘導ACC-M細胞凋亡的過程中是否起重要作用,尚未見國內外文獻報導。本研究擬對體外培養(yǎng)的ACC-M細胞經過多被銀蓮花總皂甙處理后,通過Western Blot方法,檢測Bcl-2和Bax不同時間點的含量,來驗證多被銀蓮花總皂甙誘導ACC-M凋亡過程中Bcl-2家族成員Bcl-2和Bax蛋白的表達及意義,從而為治療腺樣囊性癌植物性化學新藥的研究提供實驗依據。方法:1材料1.1 ACC-M北京大學口腔醫(yī)院提供,建立于1995年。1.2多被銀蓮花總皂甙購買于石家莊樂仁堂藥店(產地為黑龍江省),于河北醫(yī)科大學藥學院經溶解與溶劑萃取提純得到。2實驗方法2.1藥液制備多被銀蓮花總皂甙用DMSO溶解制備成20mg/m L儲存液,于-20℃冰箱中保存,使用時用DMSO濃度小于0.001%的培養(yǎng)液稀釋。2.2細胞培養(yǎng)將10%胎牛血清和鏈霉素(100ug/m L)、青霉素(100U/m L)放入RPMI1640培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2、濕度飽和的恒溫箱內培養(yǎng),每24~48小時傳1代,用0.04%EDTA和0.25%胰蛋白酶(1:1)混合液消化并傳代。2.3細胞接種以及藥物處理用消化液將處于對數生長期的細胞消化后制成4.0×106個/m L的細胞懸液,再將對照組、24h組、48h組、72h組,共四個培養(yǎng)瓶中分別接種2m L細胞懸液,存放于培養(yǎng)箱。經過24小時細胞貼壁后,再進行藥物處理。把20mg/m L的多被銀蓮花總皂甙儲存液稀釋成濃度為50ug/m L的溶液,從培養(yǎng)箱中取出貼壁后的細胞,把培養(yǎng)液丟棄,于24h,48h,72h各組中分別加入多被銀蓮花總皂甙溶液2m L(濃度為50ug/m L),對照組加入二甲基亞砜的RPMI1640培養(yǎng)液2m L(濃度為50ug/m L)。待藥物作用24、48、72小時后,提取各組細胞組織蛋白。2.4提取細胞組織蛋白將每一組細胞用PBS洗滌兩次,用消化液消化后制成細胞懸液,移入相應EP管中。3000rmp,4℃,15分鐘離心。把上清液吸出,留沉淀,這一次用衡鹽溶液洗滌吹打,800rmp,離心5分鐘,再次把上清液吸出。往各組中分別加入400u L細胞裂解液,并震蕩均勻,放在冰上裂解約30分鐘。細胞裂解后離心15分鐘(4℃,13000rmp),結束后,提取上清液就是細胞蛋白,將細胞蛋白分別裝入相應的EP管中,置于-80℃冰箱保存。2.5蛋白的定量本實驗在波長為570nm下使用分光光度法測定測定各樣本吸光度值。根據標準曲線擬合樣品的蛋白濃度。2.6采用western blot檢測Bax和Bcl-2的表達經SDS--PAGE(電泳);轉膜;封閉;孵育;洗滌;將β-actin條帶作為作為對照,奧德賽掃描成像系統的進行各波段灰度值測定,半定量測定。采用統計學軟件對結果進行方差分析。3統計分析實驗重復三次,收集所得的實驗數據,應用統計學方法分析實驗結果。結果:Western Blot結果顯示:經50ug/m L多被銀蓮花總皂甙處理后,ACC-M細胞中促凋亡Bax蛋白的表達量隨著藥物作用時間延長而增加,經灰度值分析Bax蛋白的表達量與對照組相比:24h組的蛋白表達量增加了19.6%(P0.05),48h組的蛋白表達量增加了35.9%(P0.05),72h組的蛋白表達量增加了57.2%(P0.05),差異均有統計學意義。同時,Bcl-2蛋白的表達量隨藥物作用時間延長降低,經灰度值分析Bcl-2蛋白的表達量與對照組相比:24h組的蛋白表達量降低了21.9%(P0.05),48h組的蛋白表達量降低了40.0%(P0.05),72h組蛋白表達量降低了45.2%(P0.05),均有統計學意義。經統計學分析,隨著多被銀蓮花總皂甙作用時間的延長,Bax/Bcl-2的比值逐漸增大,對照組比值為:0.42±0.009、0.43±0.012、0.43±0.010,無顯著性差異(P0.05);24小時組比值為:0.64±0.009;48小時組比值為:0.97±0.023;72小時組比值為:1.24±0.042,有顯著差異(P0.05)。結論:多被銀蓮花總皂甙誘導ACC-M細胞凋亡,與其能夠通過增加Bax蛋白的表達,同時降低Bcl-2蛋白的表達,導致Bax/Bcl-2蛋白比例增加有關。
【關鍵詞】：多被銀蓮花總皂甙 腺樣囊性癌 凋亡 Bcl-2 Bax
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.87
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 前言11-13
• 材料與方法13-20
• 結果20-21
• 附圖21-24
• 附表24-25
• 討論25-28
• 結論28-29
• 參考文獻29-31
• 綜述 Bcl-2 基因家族及其抑制劑與腫瘤治療研究進展31-39
• 參考文獻36-39
• 致謝39-40
• 個人簡歷40

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本文編號：256198