【摘要】：在臨床正畸治療中,錯(cuò)位牙定向移動(dòng)是成、破骨活動(dòng)相互協(xié)調(diào)的結(jié)果。在牙周膜受壓應(yīng)力側(cè),破骨細(xì)胞主導(dǎo)的優(yōu)勢(shì)破骨吸收活動(dòng)是正畸牙矯治性移動(dòng)的前提;而在張應(yīng)力側(cè),成骨細(xì)胞主導(dǎo)的優(yōu)勢(shì)新骨沉積活動(dòng)能修復(fù)正畸牙移動(dòng)中形成的牙槽骨缺損,是正畸牙矯治性移動(dòng)中安全性的根本保證。但這種新骨沉積活動(dòng)所需成骨細(xì)胞的來(lái)源過(guò)去一直存在爭(zhēng)議。受Seo等成功分離培養(yǎng)人牙周膜干細(xì)胞(human periodontal ligament stem cells,PDLSC)的啟發(fā),本課題組前期成功完成了動(dòng)態(tài)張應(yīng)力促PDLSC向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的實(shí)驗(yàn)研究,證實(shí)PDLSC是矯治性牙位移動(dòng)與牙槽骨應(yīng)力改建過(guò)程中成骨細(xì)胞的主要來(lái)源。在合適的臨床階段增強(qiáng)PDLSC應(yīng)力成骨作用,理論上能促進(jìn)正畸牙固位,改善正畸過(guò)程中的牙周損傷,對(duì)提高臨床矯治質(zhì)量和安全性具有重要意義。但PDLSC分化早期啟動(dòng)階段何種信號(hào)通路發(fā)揮了決定性作用,目前尚未得到充分研究。對(duì)人體其它位置間充質(zhì)干細(xì)胞分化調(diào)控機(jī)制的研究表明:Notch1信號(hào)通路在多種組織器官的間充質(zhì)干細(xì)胞早期分化調(diào)控中扮演重要角色,可能直接決定間充質(zhì)干細(xì)胞的分化命運(yùn)。由于PDLSC本質(zhì)上是一種位于牙周膜特殊位置的間充質(zhì)干細(xì)胞,受其他學(xué)者對(duì)Notch1信號(hào)研究的啟發(fā),我們推測(cè)PDLSC應(yīng)力分化早期可能也受到Notch1信號(hào)的調(diào)控。為驗(yàn)證此猜想,我們?cè)O(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn),以激動(dòng)劑重組人Jagged1蛋白(Jagged1)、抑制劑γ-分泌酶抑制劑(γ-Secretase Inhibitor,DPAT)調(diào)控Notch1信號(hào)通路,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)Western Blot(WB)方法檢測(cè)Notch1信號(hào)通路胞內(nèi)段(Notch intracellular domain,NICD)、PDLSC成骨標(biāo)志物ALP和BMP2表達(dá)變化,以驗(yàn)證Notch1信號(hào)通路對(duì)PDLSC應(yīng)力分化過(guò)程的影響。目的:在細(xì)胞應(yīng)力實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)化學(xué)方法調(diào)控PDLSC中Notch1信號(hào)表達(dá),探究動(dòng)態(tài)張應(yīng)力條件下Notch1通道在PDLSC分化過(guò)程中發(fā)揮的作用。方法1.分離、體外培養(yǎng)和鑒定人牙周膜干細(xì)胞在日常臨床實(shí)踐中隨機(jī)選取牙體牙周狀況均健康,且年齡為14~20周歲需正畸拔除前磨牙的患者,經(jīng)充分解釋知情同意后,取其剛拔除的新鮮正畸牙。自冠方向根方單向刮取根中段牙周膜組織,以Ⅰ型膠原酶恒溫37oC消化45分鐘,消化完成后收集組織塊,加入培養(yǎng)液并重新制懸后種于培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)孔底接近80%左右面積時(shí)以有限稀釋法分選PDLSC并傳代。取第4~6代PDLSC以免疫熒光檢測(cè)角蛋白、波形蛋白確定細(xì)胞組織來(lái)源;通過(guò)成骨及成脂誘導(dǎo)分化后以茜素紅和油紅O染色鑒定細(xì)胞多向分化能力,確定所獲的細(xì)胞為PDLSC。2.PDLSC應(yīng)力分化早期過(guò)程中Notch1信號(hào)通路的變化趨勢(shì)該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)目的是了解PDLSC應(yīng)力分化過(guò)程早期,Notch1通路的表達(dá)變化情況。將傳至第4~6代PDLSCs接種于應(yīng)力加載專(zhuān)用Bio Flex硅膠底膜六孔培養(yǎng)板內(nèi)。采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化Flexercell-4000 tension動(dòng)態(tài)張應(yīng)力加載裝置進(jìn)行應(yīng)力加載,應(yīng)力加載程序?yàn)樾巫兟?-12%的正弦波,頻率為0.1Hz即每舒張后回復(fù)一次,每次持續(xù)5s。連續(xù)作用時(shí)間分別為:0h、6h、12h、24h,每個(gè)時(shí)間段結(jié)束后WB檢測(cè)。WB檢測(cè)處理后PDLSC早期分化成骨標(biāo)志物ALP、BMP2以反映PDLSC分化情況;Notch1信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白NICD的表達(dá),以反映Notch1信號(hào)通路變化情況。3.Notch1信號(hào)通路對(duì)PDLSC應(yīng)力條件下分化分化過(guò)程的調(diào)控作用通過(guò)DAPT抑制、Jagged1激活Notch1信號(hào)通路,探索其對(duì)PDLSC應(yīng)力分化的影響。抑制劑組(記為DAPT組)加入DAPT根據(jù)說(shuō)明書(shū)建議和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用10μmol/L;激動(dòng)劑組(記為Jagged1組)加入濃度為10ng/L的Jagged1,該濃度根據(jù)文獻(xiàn)與本實(shí)驗(yàn)組前期研究確定;溶劑對(duì)照組(記為DMSO組)加入溶劑DMSO,終濃度與DAPT組相同為1x10~(-2)mol/L;作用時(shí)間分別為:0h、6h、12h、24h。WB檢測(cè)Notch1信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白NICD的表達(dá)以及PDLSC早期分化成骨標(biāo)志物ALP、BMP2。結(jié)果1.成功通過(guò)有限稀釋法從離體正畸牙上分離培養(yǎng)得到純化PDLSC。光鏡下胞體細(xì)長(zhǎng),呈多邊形或長(zhǎng)梭形;具有較強(qiáng)單克隆形成能力,生長(zhǎng)速度較快;螺旋或渦漩狀排列,低倍鏡下可見(jiàn)多個(gè)渦旋中心;細(xì)胞單層排列。所獲得的細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色后,胞體波形蛋白陽(yáng)性且不表達(dá)角蛋白,證明其屬于間充質(zhì)組織無(wú)上皮來(lái)源污染;化學(xué)誘導(dǎo)成骨實(shí)驗(yàn),處理組14d后有礦化結(jié)節(jié)形成,能被茜素紅染成紅色;化學(xué)誘導(dǎo)成脂,處理組14d后胞體內(nèi)有脂滴形成,大小不一,能被油紅O染色。這些結(jié)果說(shuō)明分離培養(yǎng)所獲得細(xì)胞具有較強(qiáng)多向分化潛力且為間充質(zhì)組織來(lái)源,符合PDLSC特征。2.經(jīng)加力設(shè)備連續(xù)施加動(dòng)態(tài)張應(yīng)力0h、6h、12h、24h后,PDLSC早期分化成骨標(biāo)志物ALP、BMP2表達(dá)成上升趨勢(shì)(P0.05);Notch1信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白NICD表達(dá)呈下降趨勢(shì),PDLSC應(yīng)力分化早期Notch1通路處于抑制狀態(tài)。3.DAPT作用下Notch1通路關(guān)鍵蛋白NICD的表達(dá)量下降大于非處理組(P0.05),DAPT成功抑制Notch1通路;DAPT處理組應(yīng)力加載后PDLSC早期分化成骨標(biāo)志物ALP、BMP2表達(dá)成上升趨勢(shì),且表達(dá)量大于非處理組(P0.05),分化為成骨細(xì)胞能力上升。4.Jagged1作用下Notch1通路關(guān)鍵蛋白NICD的表達(dá)量增加大于非處理組(P0.05),Jagged1成功激活Notch1通路;Jagged1處理組應(yīng)力加載后PDLSC早期分化成骨標(biāo)志物ALP、BMP2表達(dá)依然呈上升趨勢(shì),但表達(dá)量小于非處理組(P0.05),PDLSC分化為成骨細(xì)胞能力下降。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)證實(shí):①在PDLSC應(yīng)力分化早期過(guò)程中,Notch1信號(hào)通路處于抑制狀態(tài)。②抑制劑下調(diào)Notch1表達(dá)后,PDLSC在應(yīng)力作用下分化為成骨細(xì)胞的趨勢(shì)增強(qiáng)。③激動(dòng)劑上調(diào)Notch1表達(dá)后,PDLSC在應(yīng)力作用下分化為成骨細(xì)胞的趨勢(shì)減弱。這些數(shù)據(jù)表明:Notch1信號(hào)通路參與了PDLSC應(yīng)力分化的早期過(guò)程,并發(fā)揮了抑制分化的作用。我們過(guò)去的工作已經(jīng)證明:PDLSC應(yīng)力分化是正畸治療中牙移動(dòng)后再固位于牙槽骨成骨作用所需成骨細(xì)胞的主要來(lái)源,PDLSC應(yīng)力分化是多種信號(hào)通路協(xié)同作用的結(jié)果,不同信號(hào)間存在眾多復(fù)雜聯(lián)系與交互作用。為進(jìn)一步完善前期工作,為指導(dǎo)臨床正畸治療提供更堅(jiān)實(shí)可靠的理論基礎(chǔ),本課題選擇尚未在PDLSC中被研究過(guò)的Notch1信號(hào)通路,完成了對(duì)其影響PDLSC早期應(yīng)力分化的初步研究。從目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以推測(cè)Notch1信號(hào)通路對(duì)PDLSC應(yīng)力分化過(guò)程發(fā)揮抑制作用。PDLSC在應(yīng)力作用下成骨分化是正畸牙固位的生物學(xué)基礎(chǔ),在合適的臨床治療階段通過(guò)下調(diào)Notch1通路活性,促進(jìn)PDLSC成骨分化,理論上可以提高臨床治療的安全性,此實(shí)驗(yàn)結(jié)果還有望用于牙周疾病造成的牙槽骨缺損修復(fù)。通過(guò)我們建立的動(dòng)態(tài)張應(yīng)力實(shí)驗(yàn)研究模式,能更深入地了解Notch1通路在PDLSC應(yīng)力分化過(guò)程中的具體分子調(diào)控機(jī)制。相信我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果能拓寬Notch1在口腔正畸方面的應(yīng)用前景,為Notch1信號(hào)成為臨床治療新的作用靶點(diǎn)提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R783.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2386667