本文選題：Pannexin3 + 半通道　； 參考：《武漢大學》2014年博士論文

【摘要】：第一部分：Pannexin3在牙髓組織及成牙本質細胞中的表達及分布 目的：明確Pannexin3基因及蛋白在牙髓組織及成牙本質細胞中的表達及分布情況。 方法：收集15-20歲的健康正畸牙或者智齒,提取牙髓組織mRNA,采用PCR技術檢測牙髓內(nèi)Pannexin3基因的相對含量；應用組織免疫熒光方法觀察牙髓組織中Pannexin3蛋白表達及分布情況。采用組織塊法培養(yǎng)牙髓干細胞,誘導分化為成牙本質細胞,利用PCR、Western blot、細胞免疫熒光技術從基因及蛋白水平鑒定成牙本質細胞中Pannexin3的表達及分布。 結果：組織塊法體外培養(yǎng)牙髓細胞,經(jīng)礦化誘導7天后細胞分化為成牙本質細胞。PCR、Western blot檢測結果顯示牙髓組織及成牙本質細胞中有Pannexin3基因及蛋白表達,免疫熒光結果發(fā)現(xiàn)Pannexin3蛋白主要分布于人牙髓組織的成牙本質細胞層的胞體及細胞突起部分和成牙本質細胞胞漿近胞核及細胞膜等位置。 結論：Pannexin3主要分布在人牙髓組織以及成牙本質細胞胞漿及胞膜上。 第二部分：Pannexin3參與成牙本質細胞釋放ATP 目的：研究Pannexin3縫隙連接蛋白在外界冷熱刺激下對成牙本質細胞釋放ATP的影響。 方法：構建Pannexin3過表達慢病毒轉染載體PLL3.7\CMV-PANNEXIN3\CMV-RFP,通過病毒感染獲取能夠高表達Pannexin3的成牙本質細胞；合成siRNA、構建shRNA分別干擾成牙本質細胞Pannexin3基因表達。采用PCR、Western blot技術對過表達及干擾效果進行評價。將細胞分為對照組、過表達組、siRNA干擾組、shRNA干擾組及甘珀酸(CHX)功能阻斷組共5組,對各組細胞分別進行冷熱刺激。使用奎納克林進行染色觀察細胞ATP釋放情況,通過Image Pro-plus計算熒光變化量,采用生物熒光法對釋放到細胞外的ATP含量進行測定。 結果：PCR、Western blot及熒光照片結果證明Pannexin3過表達、siRNA、shRNA能有效感染成牙本質細胞,實現(xiàn)細胞Pannexin3基因的高表達和干擾效果。冷熱刺激后成牙本質細胞內(nèi)的ATP迅速釋放到細胞外,Pannexin3過表達細胞釋放速度明顯高于對照組,使用siRNA、shRNA干擾或者CHX阻斷Pannexin3通道都能抑制冷熱刺激引起的細胞內(nèi)ATP釋放到胞外。 結論：Pannexin3能在成牙本質細胞形成半通道,冷熱刺激時細胞通過Pannexin3半通道釋放ATP到細胞外。 第三部分：ATP參與牙髓感覺神經(jīng)疼痛刺激傳遞 目的：了解ATP在牙髓感覺神經(jīng)疼痛受體激活、Ca離子流動以及疼痛刺激過程中的作用。 方法：取小鼠三叉神經(jīng)節(jié),采用免疫熒光方法檢測小鼠三叉神經(jīng)節(jié)中P2X3受體表達情況,采用酶消化法分離培養(yǎng)三叉神經(jīng)元細胞,通過形態(tài)觀察及外周蛋白免疫熒光方法進行細胞鑒定。將神經(jīng)元細胞分為ATP刺激組、α βme-ATP刺激組、A-317491抑制組共三組,采用膜片鉗技術對各組神經(jīng)元細胞在接受刺激后細胞內(nèi)Ca離子流動情況進行分析。以SD大鼠為實驗對象,磨除大鼠磨牙釉質及部分牙本質,制備牙本質敏感模型,按注射藥物不同分為：PBS、ATP、α, βme-ATP及A-317491四組,分別添加冷熱刺激,記錄刺激后5分鐘內(nèi)各組動物抬爪或者舔舐的次數(shù)。 結果：組織免疫熒光顯示P2X3受體集中分布在三叉神經(jīng)節(jié)的邊緣,散在分布于中間部分。采用酶消化法獲得三叉神經(jīng)元細胞,細胞呈現(xiàn)為網(wǎng)狀、線狀排列。ATP、 α, βme-ATP刺激三叉神經(jīng)元細胞后出現(xiàn)Ca離子內(nèi)流,A-317491能抑制Ca離子流動。冷熱刺激后牙本質敏感大鼠出現(xiàn)抬爪或者舔舐動作,ATP、α, βme-ATP能夠顯著增加動物對刺激的反應程度及頻度,而A-317491則明顯降低了動物的反應行為。 結論：ATP激活三叉神經(jīng)節(jié)上的P2X3受體,使Ca離子內(nèi)流,從而導致動物產(chǎn)生疼痛感覺。
[Abstract]:Part one: the expression and distribution of Pannexin3 in dental pulp and odontoblasts.
Objective: to clarify the expression and distribution of Pannexin3 gene and protein in dental pulp and odontoblasts.
Methods: a 15-20 year old healthy orthodontic tooth or wisdom tooth was collected to extract the mRNA of the pulp tissue. The relative content of Pannexin3 gene in the pulp was detected by PCR technique. The expression and distribution of Pannexin3 protein in the pulp tissue were observed by tissue immunofluorescence. The tissue block method was used to cultivate the pulp stem cells and induce the differentiation into the dentin formation. The expression and distribution of Pannexin3 in odontoblasts were identified by PCR, Western blot and cellular immunofluorescence.
Results: the dental pulp cells were cultured in vitro by tissue mass method. After 7 days of mineralization, the cells differentiated into odontoblast.PCR. The results of Western blot detection showed that there were Pannexin3 gene and protein expression in dental pulp and odontoblast cells. The results of immunofluorescence showed that the main Pannexin3 protein was distributed in the odontoblast layer of human dental pulp tissue. The location of cell bodies and cell protrusions and odontoblasts, cytoplasm, nuclei and cell membrane.
Conclusion: Pannexin3 is mainly distributed in human dental pulp and in the cytoplasm and membrane of odontoblasts.
The second part: Pannexin3 is involved in odontoblast release from ATP.
Objective: To study the effect of Pannexin3 connexin on the release of ATP from odontoblasts in cold and heat stimuli.
Methods: the Pannexin3 overexpressed lentivirus transfection vector PLL3.7CMV-PANNEXIN3CMV-RFP was constructed to obtain the odontoblast cells with high expression of Pannexin3 through viral infection, and siRNA was synthesized and shRNA interfered with the expression of Pannexin3 gene in odontoblast cells. PCR, Western blot technique was used to evaluate the overexpression and interference effect. The cells were divided into the control group, the overexpression group, the siRNA interference group, the shRNA interference group and the CHX function block group in 5 groups. The cells of each group were treated with cold and hot stimulation. The ATP release of the cells was observed by the coloring of krindin, the changes of fluorescence were calculated by Image Pro-plus, and the content of ATP released to the cell by bioluminescence was used. Test.
Results: PCR, Western blot and fluorescence photos showed that Pannexin3 was overexpressed, siRNA, shRNA could effectively infect dentin cells and realize the high expression and interference effect of the cell Pannexin3 gene. After cold and hot stimulation, the ATP in dentin cells quickly released to the cells, and the release rate of Pannexin3 overexpression cells was significantly higher than that of the control group. Blocking Pannexin3 channels with siRNA, shRNA interference or CHX can inhibit the release of intracellular ATP from cold and heat stimuli to the extracellular domain.
Conclusion: Pannexin3 can form a half channel in odontoblasts. When cold and heat stimulates, the cells release the ATP through the Pannexin3 half channel.
The third part: ATP participates in the transmission of pulp sensory nerve pain.
Objective: To investigate the role of ATP in receptor activation, Ca ion flow and pain stimulation in pulp sensory nerve pain.
Methods: the mouse trigeminal ganglia was taken and the expression of P2X3 receptor in the trigeminal ganglia of mice was detected by immunofluorescence. The trigeminal neuron cells were isolated and cultured by enzyme digestion. The cells were identified by morphological observation and peripheral protein immunofluorescence. The neuron cells were divided into ATP stimulation group, alpha beta me-ATP stimulation group, A-317491 A total of three groups of inhibition groups were used to analyze the flow of Ca ions in the cells of each group after receiving stimulation by patch clamp technique. Taking SD rats as the experimental object, the dentin sensitive model was prepared by grinding the enamel and partial dentin of the rat molars, which were divided into four groups: PBS, ATP, alpha, beta me-ATP and A-317491, respectively. Heat and cold stimulation were used to record the number of claw or licking in each group within 5 minutes after stimulation.
Results: the tissue immunofluorescence showed that the P2X3 receptor was concentrated on the edge of the trigeminal ganglion and scattered in the middle part. The trigeminal neuron cells were obtained by enzyme digestion. The cells were reticular and linear arranged in.ATP. Alpha, beta me-ATP stimulated the Ca ion internal flow after the trigeminal neuron cells, and A-317491 could inhibit the flow of Ca ions. ATP, alpha, and beta me-ATP could significantly increase the degree and frequency of response to stimulation, while A-317491 significantly reduced the response behavior of animals.
Conclusion: ATP activates the P2X3 receptor on the trigeminal ganglion, which causes Ca influx, causing the animals to feel pain.
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R780.2

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本文編號：2054164