本文選題：牙齦干細胞 + 種植體��； 參考：《山東大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：背景和目的： 隨著口腔種植的飛速發(fā)展,為了不斷滿足廣大缺牙患者的實際需求,將拔牙和種植體植入同步進行-即刻種植技術(shù)已成為修復(fù)缺失牙的一種治療趨勢。即刻種植的療程短、手術(shù)次數(shù)少、手術(shù)創(chuàng)傷小、硬組織保存較好和軟組織美學(xué)效果好并且其成功率與延期種植相近,受到越來越多的患者和臨床醫(yī)生的青睞。然而由于種植體的大小形態(tài)往往與拔牙窩不相符,使得拔牙后即刻種植的種植體與牙槽窩骨壁之間存在不同程度的間隙,或者患牙受炎癥、外傷的影響,致使周圍牙槽骨缺損甚至吸收,這些情況都嚴重影響著即刻種植種植體初期穩(wěn)定性的獲得。臨床工作即刻種植手術(shù)過程中,當(dāng)種植體與拔牙窩之間的間隙大于2mm時,通常建議進行骨引導(dǎo)再生(Guided bone regeneration,GBR)或聯(lián)合使用骨替代材料。 如何加快骨整合的速度,縮短種植體-骨界面的愈合時間,從而縮短種植療程,并且盡早實現(xiàn)種植體的早期抗力成為現(xiàn)階段口腔種植領(lǐng)域的研究熱點。 骨組織工程的發(fā)展為口腔種植體周圍骨缺損的修復(fù)帶來了新的契機。所謂的組織工程就是聯(lián)合使用種子細胞、各種生長因子和支架材料促進組織的修復(fù)與再生。種子細胞的選擇則是最基本與最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)具有高度自我更新、復(fù)制能力以及多向分化的潛能,來源于發(fā)育早期的中胚層,廣泛存在于全身多種組織,在組織工程中常被用作種子細胞。 骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)來源于骨髓,在骨組織工程中最早被用作種子細胞,但是骨髓間充質(zhì)干細胞的取材時需要抽取供者的骨髓,取材過程非常痛苦,且其隨著供者年齡的增長,其細胞數(shù)量和擴增、分化能力會出現(xiàn)明顯下降趨勢。尋找一種能夠替代骨髓間充質(zhì)干細胞并且可以彌補其缺陷的間充質(zhì)干細胞,成為干細胞研究專家的頭等大事。牙齦干細胞(Gingival derived mesenchymal stem cells,GMSCs)的成功提取,讓更多的學(xué)者開始關(guān)注研究GMSCs。因為GMSCs取材方便簡單、擴增容易、核型穩(wěn)定,在口腔再生研究中受到研究者的追捧,甚至有學(xué)者推測GMSCs在再生醫(yī)學(xué)中的修復(fù)能力甚至超過了BMSCs。 富血小板纖維蛋白(Platelet rich fibrin,PRF)是法國學(xué)者Choukroun等在PRP的基礎(chǔ)上發(fā)展了新一代血小板濃縮物,是將血液置于不含抗凝劑的試管中離心后形成的富含血小板和白細胞的纖維蛋白凝膠。PRF的凝固反應(yīng)類似于生理的過程,其纖維蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)呈柔韌多孔狀,可以有效地網(wǎng)聚血小板因子和白細胞,并能緩慢釋放其內(nèi)的多種生長因子。這些因子能夠促進細胞增殖、基質(zhì)改建及血管再生等,是組織愈合的重要調(diào)節(jié)因子。同時纖維蛋白可作為骨髓間葉細胞遷移和分化的基質(zhì)。眾多的實驗研究已經(jīng)證明,PRF能促進間充質(zhì)干細胞以及眾多前體細胞的增殖和分化,有潛在的新骨形成能力。 目前尚未見到關(guān)于牙齦干細胞在即刻種植種植體骨缺損修復(fù)過程中作用的相關(guān)報道。本實驗利用比格犬進行即刻種植,在種植體周圍制造4mm×4mm×3.5mm大小的骨缺損,將GMSCs注射到缺損區(qū)的底部的骨髓腔,然后將PRF凝膠填充到骨缺損的區(qū)域,通過硬組織切片以及脫鈣后的組織切片觀察即刻種植后種植體周圍骨缺損愈合的過程,初步探討GMSCs在即刻種植種植體周圍骨缺損修復(fù)中的作用。 材料與方法： 1.牙齦干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 本實驗從臨床上阻生齒拔除牙上獲得健康的牙齦組織,采用組織塊法獲得原代細胞。通過傳代培養(yǎng)后,取第4代細胞用于實驗。采用有限稀釋法,挑選單克隆獲得干細胞特性的牙齦干細胞進行傳代培養(yǎng)。通過流式細胞儀檢測第4代GMSCs表面抗原CD34,CD45,CD29,CD90, CD105以及STRO-1的表達。通過成纖維細胞克隆形成單位(CFU-F)實驗檢測牙齦干細胞的克隆形成能力。三向分化能力鑒定：在體外以1μM地塞米松、200μM吲哚美辛、10μM胰島素和0.5mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細胞向脂肪細胞分化,2周后用油紅O(Oil Red O)染色檢測脂肪滴的形成；以10ng/ml轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、50nM抗壞血酸磷酸鹽、0.1μM地塞米松誘導(dǎo)牙齦干細胞向軟骨細胞分化,3周后通過甲苯胺藍染色檢測軟骨特異性蛋白聚糖的形成；以0.1μM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸鈉、50mg/L抗壞血酸磷酸鹽誘導(dǎo)牙齦干細胞向成骨細胞分化,4周后進行茜素紅染色鑒定鈣化結(jié)節(jié)的形成；體外分化誘導(dǎo)實驗以不含誘導(dǎo)因子的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的同代牙齦干細胞為對照。 2.植入種植體建立即刻種植種植體周圍骨缺損后注射牙齦干細胞 健康雄性成年Beagle犬8只,行全身麻醉后小心拔除犬雙側(cè)下頜第二、第三、第四前磨牙。于遠中根拔牙窩即刻植入直徑3.6mm,長度8mm Super Line種植體。每個牙位遠中根拔牙窩處植入的種植體均緊貼牙槽窩遠中骨壁及頰舌骨壁,獲得初期穩(wěn)定性。在種植體近中制作深約4mm,頰舌向4mm,近遠中向3.5mm的類似箱型的缺損區(qū)域,將第四代GMSCs以密度為1×108/ml重懸于新鮮的培養(yǎng)液中,實驗組在缺損區(qū)的底部注射1ml細胞懸液,然后用PRF充填缺損區(qū),對照組直接在缺損區(qū)充填PRF后縫合。術(shù)后2周、4周、8周處死動物,取得含種植體的下頜骨組織塊,固定后,經(jīng)過硬組織切片以及組織塊脫鈣后組織切片通過亞甲基藍-堿性品紅染色以及HE染色,觀察缺損區(qū)種植體骨結(jié)合率以及種植體周圍新骨生成率,評價牙齦干細胞對即刻種植種植體周圍骨缺損修復(fù)的作用。 結(jié)果： 1.牙齦干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 利用組織塊法可成功分離人牙齦干細胞,經(jīng)過傳代培養(yǎng)獲得的第四代干細胞。流式細胞儀檢測其表面標記牙齦干細胞表達CD105(85.14%), CD29(95.11%),CD90(91.78%)以及Stro-1(16.21%)；而不表達CD.34(0.09%)和CD45(0.03%)。成纖維細胞克隆形成單位實驗顯示牙齦干細胞具有較強的克隆形成能力。人牙齦干細胞骨向誘導(dǎo)4周后進行茜素紅染色,發(fā)現(xiàn)有致密紅染的細胞外基質(zhì)沉積和礦化結(jié)節(jié)的形成；脂向誘導(dǎo)2周后進行油紅0染色,可見大量紅色脂滴形成；成軟骨誘導(dǎo)3周后進行甲苯胺藍染色,觀察到細胞胞質(zhì)內(nèi)有異染藍色,以上結(jié)果提示本實驗分離培養(yǎng)的牙齦干細胞具有多向分化的潛能。 2.建立即刻種植種植體周圍骨缺損動物模型以及牙齦干細胞的注射 種植體植入后的2周,種植體周圍骨缺損區(qū)域可見大量的纖維結(jié)締組織,未見明顯的骨結(jié)合,但是缺損區(qū)遠離種植體的區(qū)域可見少量的新骨生成。隨著種植體植入時間的延長,缺損區(qū)種植體周圍可以發(fā)現(xiàn)明顯的骨結(jié)合,在種植體周圍以及遠離種植體的區(qū)域均可見到新骨的生成。種植體植入4周后,缺損區(qū)實驗組與對照組的種植體骨結(jié)合率分別為51.08±0.98%,40.79±0.65%；8周后的骨結(jié)合率分別為72.83±1.09%,61.17±2.79%,其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。種植體植入2周后,缺損區(qū)新骨生成率實驗組與對照組分別為17.08±0.49%,14.30±1.25%；4周后的新骨生成率實驗組與對照組分別為47.33±3.21%,37.04±2.29%；8周后缺損區(qū)內(nèi)的新骨生成率實驗組與對照組分別為65.96±3.60%,58.83±3.36%,其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。 結(jié)論： 1、人牙齦干細胞可以在體外成功分離培養(yǎng)、擴增與純化,方法簡單,易于操作。分離培養(yǎng)所獲得牙齦干細胞具有較強的克隆能力以及三向(成脂、成骨、成軟骨)分化潛能。 2、在即刻種植骨缺損修復(fù)的動物模型上牙齦干細胞表現(xiàn)出卓越的成骨能力,能夠加速種植體周圍骨缺損的修復(fù),可以作為種子細胞應(yīng)用于種植體周圍骨缺損的修復(fù)。
[Abstract]:Background and Purpose :

In order to satisfy the actual needs of patients with missing teeth , immediate implant technology has become a therapeutic trend in the restoration of missing teeth .

How to accelerate the speed of bone integration and shorten the healing time of implant - bone interface can shorten the treatment course , and realize the early resistance of implant as a hot spot in the field of oral planting .

The development of bone tissue engineering brings new opportunities for the repair of bone defects around oral implants . The so - called tissue engineering is the combination of seed cells , growth factors and scaffold materials to promote the repair and regeneration of tissue . The selection of seed cells is the most basic and crucial link .

Bone marrow - derived mesenchymal stem cells were originally used as seed cells in bone tissue engineering , but the bone marrow of bone marrow mesenchymal stem cells was used as seed cells .

Platelet rich fibrin ( PRF ) , a French scholar , developed a new generation of platelet concentrates on the basis of PRP .

In order to investigate the effect of GMSCs on bone defect healing immediately after implant , the effects of GMSCs on the repair of bone defects around the implant were investigated .

Materials and Methods :

1 . Isolation , culture and identification of gingival stem cells

In this experiment , the healthy gingival tissues were obtained from the tooth extraction teeth . The primary cells were obtained by tissue block method . After subculture , the 4th generation cells were used for the experiment . The expression of CD34 , CD29 , CD90 , CD105 and STRO - 1 was detected by flow cytometry .
transforming growth factor - 尾1 , transforming growth factor - 尾1 , TGF - 尾1 , 50nM ascorbic acid phosphate and 0.1渭M dexamethasone on differentiation of gingival stem cells into chondrocytes , and detecting the formation of cartilage - specific protein by means of methylene blue staining after 3 weeks ;
After 4 weeks , alizarin red staining was used to identify calcified nodules .
In vitro differentiation - induced experiments were compared with the same - generation gingival stem cells cultured in a complete medium without an inducing factor .

2 . Implantation of implants for immediate implant of peri - implant bone defects and injection of gingival stem cells

In order to evaluate the effect of gingival stem cells on bone defects around the implant .

Results :

1 . Isolation , culture and identification of gingival stem cells

CD105 ( 85.14 % ) , CD29 ( 95.11 % ) , CD90 ( 91.78 % ) and Stro - 1 ( 16.21 % ) were detected by flow cytometry .
The results showed that gingival stem cells had strong clonal formation ability . After 4 weeks of induction , alizarin red staining was performed in human gingival stem cells , and the formation of dense red - stained extracellular matrix deposition and mineralized nodules was found .
After 2 weeks of lipopolysaccharide , the oil was stained with oil red 0 , and a large amount of red lipid droplets were observed .
The results suggested that the cultured gingival stem cells had multi - directional differentiation potential after 3 weeks of chondrogenic induction . The results suggested that the cultured gingival stem cells had the potential of multi - directional differentiation .

2 . Establishment of an animal model for immediate implant of peri - implant bone defects and injection of gingival stem cells

There was a large number of fibrous connective tissue around the implant in 2 weeks after implant implantation , no obvious bone union was seen in the area of the defect , but a small amount of new bone formation could be seen around the implant . As the implant implantation time was prolonged , the bone union rate of the implant was 51.08 鹵 0.98 % and 40.79 鹵 0.65 % , respectively .
After 8 weeks , the bone union rate was 72.83 鹵 1.09 % , 61.17 鹵 2.79 % , the difference was statistically significant ( p < 0.05 ) . After 2 weeks of implant implantation , the new bone formation rate in the defect area was 17.08 鹵 0.49 % and 14.30 鹵 1.25 % , respectively .
The new bone formation rate after 4 weeks was 47.33 鹵 3.21 % , 37.04 鹵 2.29 % in the experimental group and the control group , respectively .
The new bone formation rate in the defect area after 8 weeks was 65.96 鹵 3.60 % , 58.83 鹵 3.36 % in the experimental group and the control group , respectively ( p < 0.05 ) .

Conclusion :

1 , human gingival stem cells can be successfully isolated , amplified and purified in vitro , and the method is simple and easy to operate .

and 2 , the gingival stem cells show excellent osteogenic capacity on an animal model immediately planted with bone defect , can accelerate the repair of the bone defect around the implant , and can be used as a seed cell to be applied to the repair of the bone defect around the implant .
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R783.6

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本文編號：2039650