本文關鍵詞：孕酮對Aβ所致星形膠質(zhì)細胞炎癥反應的調(diào)節(jié)作用及機制研究

  更多相關文章： 阿爾茲海默 β-淀粉樣蛋白 星形膠質(zhì)細胞 孕酮 神經(jīng)炎癥反應 NLRP3 Caspase-1 自噬 神經(jīng)保護作用

【摘要】：阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease,AD)又稱老年癡呆,是以記憶和認知功能障礙為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。β淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)在腦內(nèi)大量沉積已經(jīng)被認為是AD致病的最基礎誘發(fā)因素,然而Aβ的神經(jīng)毒性機制尚未完全闡明。最近研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)炎癥反應在AD病理學發(fā)展方面起到了關鍵的調(diào)節(jié)作用。在AD病理學改變的早期階段,AD患者腦內(nèi)易感區(qū)域即開始表達上調(diào)炎癥基因并大量合成炎癥細胞因子。大量的流行病學和隨訪性實驗研究證實抑制神經(jīng)炎癥反應能夠降低AD的發(fā)病風險。神經(jīng)炎癥反應逐漸被認為是誘發(fā)或加重AD發(fā)展的另一個重要潛在影響因素。星形膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中是數(shù)量最為龐大的一類功能調(diào)節(jié)細胞。在正常生理條件下,星形膠質(zhì)細胞為神經(jīng)元提供必要的營養(yǎng)和信息加工支持,積極參與維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。然而,當星形膠質(zhì)細胞被異�；罨髸罅可舍尫叛装Y調(diào)節(jié)因子,包括促炎癥細胞因子、生長因子、補體化合物、趨化因子等,特別是IL(interleukin)-1β,IL-6,TNF(tumor necrosis factor)-α等神經(jīng)炎癥調(diào)節(jié)因子的分泌,能夠誘發(fā)或加重腦疾病的發(fā)展惡化。異常活化的星形膠質(zhì)細胞已經(jīng)成為影響神經(jīng)系統(tǒng)功能穩(wěn)定的一大不安因素。值得注意的是,在AD患者的大腦皮層和皮層下結構出現(xiàn)大量異�；罨男切文z質(zhì)細胞。這些活化的星形膠質(zhì)細胞聚集于AD患者腦內(nèi)淀粉樣蛋白和神經(jīng)纖維纏節(jié)周圍,并產(chǎn)生促炎癥調(diào)節(jié)因子。這已經(jīng)構成了AD發(fā)病早期出現(xiàn)的重要病理學現(xiàn)象。這就提示我們,調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞功能可能成為治療大腦神經(jīng)炎癥反應的重要靶點。然而,Aβ誘發(fā)星形膠質(zhì)細胞活化后神經(jīng)炎癥反應發(fā)生的分子機制尚未完全闡明。因此,全面深入研究神經(jīng)炎癥在AD發(fā)病中的致病機制,研發(fā)有針對性的AD治療藥物將具有重要現(xiàn)實意義。神經(jīng)甾體是具有神經(jīng)保護活性的甾體類物質(zhì),主要由膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元在各種甾體生成酶的作用下經(jīng)膽固醇或自外周循環(huán)進入神經(jīng)系統(tǒng)的各種前體合成分泌而成。大量研究表明神經(jīng)甾體不僅參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育,還對神經(jīng)系統(tǒng)具有營養(yǎng)支持以及促進神經(jīng)發(fā)生和增加神經(jīng)元存活等作用。神經(jīng)甾體孕酮(progesterone,pg)作為內(nèi)源性神經(jīng)活化甾體,在調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞功能上作用明顯。bashour等發(fā)現(xiàn),孕酮可以快速的抑制gnrh神經(jīng)元的活性,調(diào)控神經(jīng)元軸突的生長,調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子bdnf的合成與釋放。值得注意的是,當皮下注射給予ad模型大鼠孕酮后發(fā)現(xiàn),孕酮能顯著改善ad模型大鼠的學習與記憶功能,然而其對于ad的神經(jīng)保護性機制尚需要進一步闡明。本實驗室前期的研究發(fā)現(xiàn),孕酮能夠抑制aβ誘導的神經(jīng)元線粒體相關性凋亡,但是對于孕酮調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞功能上的作用尚不得而知。星形膠質(zhì)細胞作為中樞系統(tǒng)中重要的神經(jīng)炎癥調(diào)節(jié)細胞,維持其功能穩(wěn)定對于調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)炎癥反應方面起著重要的作用。本課題以原代培養(yǎng)的大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞為實驗基礎擬采用aβ體外誘導星形膠質(zhì)細胞過度活化構建ad神經(jīng)炎癥細胞模型,討論aβ誘導星形膠質(zhì)細胞功能損傷的分子機制,并進一步研究神經(jīng)甾體孕酮對aβ所致星形膠質(zhì)細胞功能損傷的神經(jīng)保護性作用及其可能調(diào)控機制。第一部分aβ對星形膠質(zhì)細胞的異�；罨饔媚康�:研究aβ對原代培養(yǎng)皮層星形膠質(zhì)細胞功能的影響,進而評價aβ對星形膠質(zhì)細胞的異�；罨饔�。方法:取新生sd大鼠大腦皮層部位組織進行體外培養(yǎng),分離純化得到原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞,immofluorescence方法檢測星形膠質(zhì)細胞標志蛋白gfap以鑒定其純度。分別應用immofluorescence、westernblot、elisa方法檢測aβ對星形膠質(zhì)細胞形態(tài),gfap蛋白表達,以及促炎癥細胞因子il-1β、tnf-α分泌的影響。結果:1aβ促進星形膠質(zhì)細胞促炎癥細胞因子il-1β、tnf-α合成分泌應用aβ處理皮層星形膠質(zhì)細胞不同時間(0h,3h,6h,12h,24h),elisa檢測aβ干預下星形膠質(zhì)細胞il-1β,tnf-α分泌水平變化。結果顯示,aβ促進星形膠質(zhì)細胞il-1β,tnf-α的合成分泌,與未干預組相比,aβ干預處理6h后il-1β,tnf-α分泌水平開始出現(xiàn)顯著性提升。2aβ在星形膠質(zhì)細胞內(nèi)大量聚集應用aβ處理皮層星形膠質(zhì)細胞不同時間(0h,3h,6h,12h),immofluorescence檢測aβ在星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的動態(tài)變化。結果顯示,aβ干預星形膠質(zhì)細胞3h后在細胞內(nèi)出現(xiàn)aβ聚集,隨著aβ干預時間的延長,aβ蛋白在細胞內(nèi)的聚集程度持續(xù)增加,在細胞核附近和細胞漿中均有發(fā)現(xiàn),延緩或阻斷了星形膠質(zhì)細胞自身的降解清除。3aβ誘導星形膠質(zhì)細胞形態(tài)異常本部分通過熒光標記星形膠質(zhì)細胞微管相關蛋白gfap,觀察星形膠質(zhì)細胞的形態(tài)改變。immofluorescence結果顯示,與未干預組相比,aβ干預處理6h后星形膠質(zhì)細胞出現(xiàn)了明顯的形態(tài)改變,主要表現(xiàn)為細胞胞體膨脹,偽足收縮等。4aβ上調(diào)星形膠質(zhì)細胞內(nèi)gfap蛋白表達為進一步研究aβ對于星形膠質(zhì)細胞的異�；罨饔�,我們檢測與其活化相關的gfap蛋白表達的變化。westernblot檢測結果顯示,aβ誘導星形膠質(zhì)細胞表達gfap蛋白,與未干預組相比,當aβ干預處理6h后,gfap蛋白表達出現(xiàn)了顯著性的增加結論:aβ誘發(fā)星形膠質(zhì)細胞異�；罨�,并導致促炎癥細胞因子il-1β、tnf-α的大量合成分泌。第二部分aβ誘導星形膠質(zhì)細胞炎癥反應的機制研究目的:對aβ引起星形膠質(zhì)細胞活化后炎癥反應分子機制的探討,并深入研究外源性炎癥反應信號炎癥小體nlrp3對于aβ所致神經(jīng)炎癥反應的調(diào)節(jié)作用。方法:新生sd大鼠,取大腦皮層部位組織進行體外培養(yǎng),分離純化得到原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞,分別應用immofluorescence、westernblot方法檢測aβ對星形膠質(zhì)細胞炎癥小體nlrp3表達,以及炎癥信號調(diào)節(jié)蛋白caspase-1活化的影響。elisa方法檢測nlrp3/caspase-1外源性炎癥信號途徑對aβ所致神經(jīng)炎癥反應的調(diào)節(jié)作用。結果:1aβ促進炎癥小體nlrp3在星形膠質(zhì)細胞內(nèi)表達應用aβ處理皮層星形膠質(zhì)細胞不同時間(0h,3h,6h,12h),immofluorescence和westernblot檢測星形膠質(zhì)細胞炎癥小體nlrp3蛋白的表達。immofluorescence結果顯示,隨著aβ干預時間的延長,炎癥小體nlrp3表達逐漸增加,當aβ干預6h時,星形膠質(zhì)細胞內(nèi)nlrp3表達活化出現(xiàn)顯著的提升。westernblot結果顯示,aβ干預6h后星形膠質(zhì)細胞內(nèi)炎癥小體nlrp3表達相比對照組來說出現(xiàn)了顯著性提高。2aβ促進炎癥信號調(diào)節(jié)蛋白caspase-1在星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的活化我們進一步考察,aβ對星形膠質(zhì)細胞炎癥反應調(diào)節(jié)蛋白caspase-1活化的影響。westernblot結果顯示,aβ時間依賴型的促進caspase-1的成熟,主要表現(xiàn)為caspase-1p20片段表達的提升,aβ干預6h后caspase-1p20片段出現(xiàn)了顯著性增加,相比對照組來說出現(xiàn)了顯著性差異。當aβ干預時間到達12h后caspase-1進一步成熟(caspase-1p20表達提升),但是相比aβ干預6h后caspase-1p20表達量并無顯著性差異。3nlrp3/caspase-1外源性炎癥信號調(diào)節(jié)aβ所致的星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)炎癥反應我們進一步考察了,nlrp3/caspase-1外源性炎癥信號對于aβ所致的星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)炎癥反應的調(diào)節(jié)影響。研究結果顯示,aβ干預處理6h后il-1β,tnf-α分泌水平明顯提升。與aβ干預組相比,caspase-1抑制劑z-yvad-fmk顯著性的降低了aβ誘導下il-1β、tnf-α的合成分泌。結論:nlrp3/caspase-1外源性炎癥信號的激活介導參與aβ所致星形膠質(zhì)細胞的神經(jīng)炎癥反應。第三部分孕酮對aβ所致星形膠質(zhì)細胞炎癥反應的調(diào)節(jié)作用目的:研究神經(jīng)甾體pg對于aβ所致星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)炎癥反應的神經(jīng)調(diào)節(jié)作用,深入探討孕酮可能的神經(jīng)調(diào)節(jié)機制及相關炎癥信號途徑。方法:取新生sd大鼠大腦皮層原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞,elisa方法檢測pg對于aβ所致星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)炎癥反應的調(diào)節(jié)。應用westernblot方法檢測pg對于aβ所致星形膠質(zhì)細胞內(nèi)炎癥小體nlrp3表達,以及炎癥信號調(diào)節(jié)蛋白caspase-1活化的影響。結果:1pg抑制aβ所致的星形膠質(zhì)細胞il-1β、tnf-α的分泌不同濃度pg(0.25、0.5、1、2μm)與aβ共同處理6h,elisa檢測在aβ干預條件下,不同濃度pg對于星形膠質(zhì)細胞il-1β、tnf-α分泌水平的影響。結果顯示,1μmpg能顯著性的下調(diào)aβ所致星形膠質(zhì)細胞il-1β、tnf-α的合成分泌。另外,應用elisa檢測在aβ干預條件下,pg不同干預時間對于星形膠質(zhì)細胞il-1β、tnf-α分泌水平的影響。研究結果顯示,pg明顯減弱aβ所致星形膠質(zhì)細胞il-1β、tnf-α的分泌,與aβ處理組相比,1μmpg處理6h顯著性的降低了aβ所致的星形膠質(zhì)細胞il-1β、tnf-α的分泌。2pg調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞aβ所致nlrp3的表達活化應用westernblot檢測aβ干預條件下,pg對于星形膠質(zhì)細胞炎癥小體nlrp3表達活化的影響。結果顯示,pg干預6h時,aβ所致的炎癥小體nlrp3表達活化出現(xiàn)顯著的下降,相比aβ干預組,炎癥小體nlrp3表達出現(xiàn)了顯著的差異。3pg調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞aβ所致caspase-1的表達活化應用westernblot檢測aβ干預條件下,pg對于星形膠質(zhì)細胞caspase-1的剪切片段表達的影響(caspase-1p20)。結果顯示,與aβ干預組caspase-1p20表達量相比,pg干預6h后顯著性下調(diào)了aβ所致的caspase-1p20的表達活化。結論:神經(jīng)甾體pg顯著性的抑制aβ所致nlrp3炎癥小體在星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的表達,并通過下調(diào)caspase-1的活化抑制aβ所誘導的神經(jīng)炎癥反應。第四部分自噬對孕酮抑制aβ所致炎癥反應的調(diào)節(jié)作用及機制研究目的:研究神經(jīng)甾體pg對于星形膠質(zhì)細胞自噬功能的影響,并進一步討論自噬對于神經(jīng)甾體pg抑制aβ所致神經(jīng)炎癥反應的可能調(diào)節(jié)機制。方法:取新生sd大鼠大腦皮層原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞,elisa方法檢測自噬對pg抑制aβ所致星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)炎癥反應的影響。應用westernblot方法檢測pg對于aβ所致星形膠質(zhì)細胞自噬功能的調(diào)節(jié),并檢測自噬對于炎癥小體nlrp3及炎癥信號調(diào)節(jié)蛋白caspase-1活化的影響。結果:1自噬介導pg對aβ所致星形膠質(zhì)細胞il-1β、tnf-α分泌的影響為了深入研究自噬是否介導了pg對aβ誘導神經(jīng)炎癥反應的保護性機制。應用elisa檢測自噬誘導劑rapamycin對aβ所致星形膠質(zhì)細胞炎癥反應的調(diào)節(jié)作用。結果顯示,rapamycin顯著性的降低了aβ誘導下il-1β、tnf-α的合成分泌。自噬抑制劑3-ma明顯的抑制了pg對下il-1β和tnf-α合成分泌的調(diào)節(jié)作用,相比pg保護組,il-1β和tnf-α的合成分泌出現(xiàn)了顯著性的升高。2pg促進aβ所致的星形膠質(zhì)細胞自噬啟動為深入探討pg對于aβ干預下星形膠質(zhì)細胞自噬功能的影響。westernblot結果顯示,pg激活了星形膠質(zhì)細胞自噬水平,相比aβ干預組,lc3-ii表達量出現(xiàn)了明顯的提升,并促進了lc3-i到lc3-ii的轉(zhuǎn)變。與此同時,pg干預后,beclin-1表達量也出現(xiàn)了顯著性的提升。3pg促進aβ所致的星形膠質(zhì)細胞自噬活化我們應用westernblot檢測自噬降解底物調(diào)節(jié)蛋白p62表達量變化。研究結果顯示,pg明顯的提升了aβ干預下星形膠質(zhì)細胞自噬功能,相比aβ干預組,p62蛋白顯著性的降低。自噬抑制劑3-ma則阻斷了pg對于星形膠質(zhì)細胞自噬功能的活化作用,主要表現(xiàn)為lc3-ii表達的下降,lc3-i到lc3-ii的轉(zhuǎn)化降低,以及p62蛋白表達翻轉(zhuǎn)性的增加。4pg調(diào)節(jié)aβ誘導下星形膠質(zhì)細胞akt/mtor信號為進一步研究pg對于自噬活化功能的影響,我們檢測了星形膠質(zhì)細胞內(nèi)akt/mtor信號通路的表達變化。結果顯示,pg顯著性的抑制了aβ誘導條件下星形膠質(zhì)細胞akt/mtor信號通路。5自噬介導pg調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞aβ所致nlrp3的表達應用westernblot檢測aβ干預條件下,自噬對于星形膠質(zhì)細胞炎癥小體nlrp3表達的調(diào)節(jié)作用。自噬誘導劑rapamycin,有效的促進了自噬對于aβ所致炎癥小體nlrp3聚集的降解清除。自噬抑制劑3-ma顯著性的阻斷了pg對于炎癥小體nlrp3的調(diào)節(jié)作用,與pg保護組相比,nlrp3蛋白顯著性的增加。6自噬介導pg調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞aβ所致caspase-1的活化為了進一步研究自噬對于炎癥反應信號的調(diào)節(jié)作用,我們檢測了炎癥信號調(diào)節(jié)蛋白caspase-1的表達水平變化。研究結果顯示,相比aβ干預組星形膠質(zhì)細胞,自噬誘導劑rapamycin顯著性的抑制aβ所致星形膠質(zhì)細胞Caspase-1的活化,表現(xiàn)為Caspase-1 p20/pro-Caspase-1比例明顯的降低。在PG保護干預下,Aβ引起的Caspase-1活化同樣被顯著性的抑制。但是自噬抑制劑3-MA則阻斷了PG對于Aβ引起的Caspase-1活化的調(diào)節(jié)作用。結論:PG能夠明顯的提升Aβ誘導下星形膠質(zhì)細胞自噬功能,加速了自噬對于自噬底物的處理清除,特別是對于炎癥復合物小體NLRP3的清除作用,通過調(diào)節(jié)NLRP3/Caspase-1炎癥反應信號,抑制Aβ所致的星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)炎癥反應。綜上所述,本實驗以Aβ干預原代培養(yǎng)皮層星形膠質(zhì)細胞構建AD神經(jīng)炎癥細胞模型,研究神經(jīng)甾體PG對Aβ所致星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)炎癥反應的保護性作用及其可能調(diào)控機制。研究發(fā)現(xiàn),PG能夠明顯抑制Aβ所致的神經(jīng)炎癥反應,1μM PG處理6h顯著性的降低了Aβ干預所致的星形膠質(zhì)細胞炎癥因子IL-1β、TNF-α的合成分泌。進一步研究發(fā)現(xiàn),PG能夠抑制Aβ引起的星形膠質(zhì)細胞炎癥小體NLRP3和炎癥信號調(diào)節(jié)蛋白Caspase-1的表達活化,進而緩解Aβ引起的神經(jīng)炎癥反應,提示孕酮通過抑制外源性炎癥信號NLRP3/Caspase-1調(diào)節(jié)Aβ引起的星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)炎癥反應;我們還發(fā)現(xiàn)PG能夠上調(diào)Aβ所致星形膠質(zhì)細胞自噬功能異常。PG通過活化星形膠質(zhì)細胞自噬功能,調(diào)節(jié)NLRP3/Caspase-1炎癥反應信號,進一步抑制Aβ所致的星形膠質(zhì)細胞神經(jīng)炎癥反應。綜上所述,神經(jīng)甾體PG在Aβ所引起的神經(jīng)炎癥反應方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用,PG的這種神經(jīng)保護性作用將為開發(fā)有效的AD防治策略提供了可參考的新型治療方案。
【關鍵詞】：阿爾茲海默 β-淀粉樣蛋白 星形膠質(zhì)細胞 孕酮 神經(jīng)炎癥反應 NLRP3 Caspase-1 自噬 神經(jīng)保護作用
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 中文摘要5-12
• 英文摘要12-22
• 英文縮寫22-24
• 引言24-26
• 第一部分 Aβ 對星形膠質(zhì)細胞的異�；罨饔�26-45
• 前言26-28
• 材料與方法28-34
• 結果34-36
• 附圖36-39
• 討論39-41
• 小結41-42
• 參考文獻42-45
• 第二部分 Aβ 誘導星形膠質(zhì)細胞炎癥反應的機制研究45-61
• 前言45-47
• 材料與方法47-49
• 結果49-51
• 附圖51-55
• 討論55-57
• 小結57-58
• 參考文獻58-61
• 第三部分 酮對Aβ 所致星形膠質(zhì)細胞炎癥反應的調(diào)節(jié)作用61-79
• 前言61-63
• 材料與方法63-66
• 結果66-68
• 附圖68-72
• 討論72-75
• 小結75-76
• 參考文獻76-79
• 第四部分 噬對孕酮抑制Aβ 所致炎癥反應的調(diào)節(jié)作用及機制研究79-102
• 前言79-80
• 材料與方法80-84
• 結果84-88
• 附圖88-94
• 討論94-98
• 小結98-99
• 參考文獻99-102
• 結論102-103
• 綜述一 癥小體在阿爾茲海默病中的作用103-118
• 參考文獻111-118
• 綜述二 噬與炎癥之間的分子機制118-132
• 參考文獻126-132
• 致謝132-133
• 個人簡歷133

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 吳潔;吳紅海;于洋;秦亞彬;韓曉磊;侯艷寧;;孕酮抑制Aβ誘導星形膠質(zhì)細胞活化所致神經(jīng)元損傷[J];中國藥理學通報;2014年11期

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本文編號：947343