本文關(guān)鍵詞：低分子量硫酸軟骨素對Aβ引起神經(jīng)毒性的防治作用及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 低分子量硫酸軟骨素(LMWCS) 淀粉樣蛋白β(Aβ) 神經(jīng)保護(hù) 阿爾茨海默病(AD)

【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)又被稱為老年癡呆,是一類常見的神經(jīng)退行性疾病,它的臨床特點(diǎn)是患者表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶障礙或認(rèn)知功能減退,病理特征是出現(xiàn)淀粉樣蛋白p(Aβ)沉積產(chǎn)生的老年斑(SP)、神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs),以及神經(jīng)細(xì)胞大量丟失或死亡。Ap在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出較明顯的神經(jīng)毒性,從而在AD的發(fā)病機(jī)制中起到了重要作用。因此,Ap可以作為神經(jīng)細(xì)胞毒性的誘導(dǎo)分子,它在AD的治療與藥物的發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮了巨大的作用。本課題的研究對象為低分子量硫酸軟骨素(LMWCS),它是由來源于鯊魚軟骨中的硫酸軟骨素C經(jīng)過氧化降解,并用相對分子質(zhì)量(Mr)截留值為2000 Da和5000 Da的超濾膜截留后得到的物質(zhì),將Mr2000 Da、2000-5000 Da、5000 Da的3個(gè)組分命名為LMWCS-A、B、C,氧化降解后的總組分命名為LMWCS-D,這4個(gè)組分的平均Mr分別為1173、3928、6146、5846。本研究是以Ap作為研究靶點(diǎn),在體外觀察了LMWCS 對 AP25-35損傷大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞以及神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用,并在細(xì)胞水平上探討了LMWCS抗Aβ25-35申經(jīng)毒性損傷的相關(guān)作用機(jī)制,還觀察了LMWCS對側(cè)腦室注射Aβ1-40所致AD小鼠模型學(xué)習(xí)記憶功能的影響及對其機(jī)制進(jìn)行了初步的研究。1 LMWCS對Aβ25-35 引起神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究本研究通過四甲基偶氮唑鹽(MTT)的方法觀察了不同Mr的LMWCS對AP25-35誘導(dǎo)PC12及SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Aβ25-35可以明顯降低神經(jīng)細(xì)胞的MTT還原能力,減少存活細(xì)胞的數(shù)量；而加入50、100和200μg/mL LMWCS預(yù)孵育后,Aβ25-35所引起神經(jīng)細(xì)胞損傷受到了抑制,神經(jīng)細(xì)胞的存活率增加,其中加入LMWCS-B的神經(jīng)細(xì)胞存活率最高,并且隨著LMWCS濃度增加,對神經(jīng)細(xì)胞的改善作用增強(qiáng),提示不同Mr的LMWCS均可明顯抑制Aβ25-35所引起的神經(jīng)細(xì)胞毒性,并且LMWCS-B(平均Mr為3928)對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用最明顯。因此,后期實(shí)驗(yàn)均采用此LMWCS組分來進(jìn)行。本研究還觀察了經(jīng)過LMWCS預(yù)孵育再加入Aβ25-35進(jìn)行損傷、Aβ25-35與LMWCS共孵育以及Aβ25-35先進(jìn)行損傷再加LMWCS保護(hù)3種處理方式的神經(jīng)細(xì)胞的存活情況,從而確定LMWCS抗Aβ25-35神經(jīng)毒性損傷的作用環(huán)節(jié)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在這3種處理方式中Aβ25-35對神經(jīng)細(xì)胞均有損傷,LMWCS給藥組的細(xì)胞存活率高于模型組,并且LMWCS預(yù)孵育方式的細(xì)胞存活率高于其他方式,表明LMWCS能夠多環(huán)節(jié)的抑制Aβ25-35的神經(jīng)毒性。LMWCS能夠抑制Aβ25-35誘導(dǎo)PC12和(?)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)毒性,但其抑制作用的相關(guān)機(jī)制不明確。因此,本研究在細(xì)胞水平上探討了LMWCS保護(hù)Aβ25-35誘導(dǎo)神經(jīng)毒性損傷的作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn),30μmol/L Aβ25-35可以明顯誘導(dǎo)PC12和SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生凋亡,而加入50、100和200μg/ml的LMWCS預(yù)孵育后,PC12和SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡均明顯受到抑制,凋亡率隨著濃度的增加而呈現(xiàn)劑量依賴性降低。深入研究LMWC S抗Aβ25-35所致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn),LMWCS能夠明顯抑制Aβ25-35誘導(dǎo)產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度升高、自由基的形成以及細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量的增加,還能夠降低線粒體膜電位(MMP)以及抑制凋亡促進(jìn)蛋白Bax和Caspase-9、-3蛋白表達(dá)的升高,并且可以激活凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá),表明LMWCS抑制Aβ25-35誘導(dǎo)產(chǎn)生的神經(jīng)細(xì)胞毒性損傷主要是通過抑制自由基的產(chǎn)生、提高自由基的清除速率、抑制線粒體障礙以及抑制細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的升高而增加了凋亡抑制相關(guān)蛋白的表達(dá)、阻斷了下游凋亡促進(jìn)蛋白的表達(dá),從而最終抑制Aβ25-35誘導(dǎo)產(chǎn)生的PC12和SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡。2 LMWCS對側(cè)腦室注射Aβ1-40所致AD動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能的影響及機(jī)制的研究本研究利用側(cè)腦室注射Aβ1-40所致老年癡呆癥小鼠為模型,采用曠場實(shí)驗(yàn)(OFT)和Morris水迷宮(MWM)的方法觀察LMWCS對AD小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的改善作用,并在細(xì)胞及分子水平研究了LMWCS對AD小鼠作用的可能分子機(jī)制。結(jié)果表明,側(cè)腦室注射Aβ1-40能夠明顯損傷小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能,給予LMWCS后,在OFT測試中,Ⅰ.MWCS增加了AD小鼠在盒內(nèi)的穿越格數(shù)、站立次數(shù)以及小鼠進(jìn)行自我修飾的次數(shù)；在MWM測試的過程中,LMWCS可以縮短小鼠潛伏期和游泳路程,在空間探索實(shí)驗(yàn)中可以減少AD小鼠第一次到達(dá)原平臺的時(shí)間、增加小鼠穿越原平臺區(qū)域的次數(shù)、增加小鼠在目標(biāo)象限的時(shí)間和路程,從而說明LMWCS可以明顯改善側(cè)腦室注射Ap1-40所致AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。學(xué)習(xí)記憶測試結(jié)束后,小鼠經(jīng)斷頭處死,剝離大腦海馬和皮層區(qū),采用比色法測定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、Na+/K+-ATP酶活力及丙二醛(MDA)含量,測定膽堿乙酰化轉(zhuǎn)移酶(ChAT)和乙酰膽堿酯酶(AC hE)活性。結(jié)果表明,LMWCS可以明顯提高Aβ1-40所致AD小鼠海馬和皮層區(qū)中抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性,以及Na+/K+-ATP酶、Ch AT的活性,降低了MDA的含量和AChE的活性,提示LMWCS可以改變Aβ1-40所致AD小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平,維持小鼠腦內(nèi)能量代謝的穩(wěn)定性,改善了小鼠大腦中海馬和皮層區(qū)的膽堿能系統(tǒng)功能。小鼠大腦切片進(jìn)行HE染色后發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)組織形態(tài)學(xué)改變,Aβ1-40可導(dǎo)致腦組織海馬CA1區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)損傷,而給予LMWCS后神經(jīng)元的損傷情況改善。免疫組化結(jié)果顯示,Aβ1-40能夠增加小鼠大腦海馬CA1區(qū)Caspase-9、弓的活性。而L MWCS可以降低Caspase-9、-3的表達(dá),使其陽性細(xì)胞數(shù)量減少,起到抗凋亡的作用。Western blot結(jié)果顯示,LMWCS在凋亡過程中表現(xiàn)出了抗凋亡作用,可激活凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá),抑制在小鼠細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用的Bax、Caspase-9、-3蛋白表達(dá),最終起到了降低了細(xì)胞凋亡的作用。LMWCS的作用機(jī)制可能與降低Aβ神經(jīng)毒性作用,抑制神經(jīng)元的凋亡等有關(guān),可能在治療AD的作用中具有一定的作用。綜上所述,本研究第一次在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中評價(jià)LMWCS對Ap誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。LMWCS具有對Ap所致AD模型的保護(hù)作用,可有效抑制Aβ25-35誘導(dǎo)產(chǎn)生的PC12細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用,拮抗細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的升高、自由基的產(chǎn)生和聚集、線粒體的功能障礙,還可以降低凋亡促進(jìn)蛋白Bax和Caspase-9、-3蛋白表達(dá)的升高,激活凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá),最終抑制Aβ25-35所引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。與此同時(shí),LMWCS在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出明顯改善Aβ1-40所致模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的作用,并能提高模型小鼠大腦內(nèi)海馬和皮層區(qū)SOD、GSH-Px的活力水平,清除過氧化產(chǎn)物,降低MDA的含量,從而改善小鼠大腦內(nèi)氧化和抗氧化的紊亂狀態(tài),保護(hù)能量代謝關(guān)鍵酶Na+/K+-ATP酶免受氧化損傷,進(jìn)而維持腦內(nèi)能量代謝的穩(wěn)定,還能通過促進(jìn)中樞膽堿能系統(tǒng)乙酰膽堿(ACh)的合成而改善膽堿能系統(tǒng)功能,起到保護(hù)小鼠大腦的作用。因此,LMWCS可以用于預(yù)防或治療Ap誘導(dǎo)產(chǎn)生的神經(jīng)毒性,能夠作為一種抗AD的候選活性成分,用于制備治療、改善或預(yù)防認(rèn)知功能衰退相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物。
【關(guān)鍵詞】：低分子量硫酸軟骨素(LMWCS) 淀粉樣蛋白β(Aβ) 神經(jīng)保護(hù) 阿爾茨海默病(AD)
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 中文摘要11-15
• Abstract15-19
• 縮略語說明19-22
• 第一章 前言22-41
• 1 AD研究現(xiàn)狀22-24
• 2 AD發(fā)病機(jī)制的研究24-29
• 3 AD模型的制備29-32
• 4 AD的治療32-35
• 5 糖類及其衍生物抗AD研究概況35-39
• 6 本課題擬解決的問題和意義39-41
• 第二章 LMWCS對Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制探討41-71
• 1 實(shí)驗(yàn)材料41-45
• 1.1 藥品及試劑41-42
• 1.2 儀器及耗材42-44
• 1.3 工作溶液的配制44-45
• 1.4 細(xì)胞45
• 2 實(shí)驗(yàn)方法45-52
• 2.1 LMWCS的制備及分析45-46
• 2.2 細(xì)胞活力測定46-47
• 2.3 細(xì)胞凋亡測定47
• 2.4 游離鈣離子濃度測定47
• 2.5 ROS測定47-48
• 2.6 細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激及能量代謝水平測定48-49
• 2.7 MMP測定49
• 2.8 Caspase-3酶測定49-50
• 2.9 總蛋白的提取及定量50-51
• 2.10 Western blot分析51
• 2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理51-52
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-67
• 3.1 LMWCS的制備52-54
• 3.2 LMWCS對Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用54-57
• 3.3 LMWCS對Aβ25-35引起細(xì)胞凋亡的影響57
• 3.4 LMWCS對Aβ25-35引起細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度變化的影響57-59
• 3.5 LMWCS對Aβ25-35引起細(xì)胞內(nèi)ROS變化的影響59-60
• 3.6 LMWCS對Aβ25-35引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平變化的影響60-63
• 3.7 LMWCS對Aβ25-35引起的MMP變化的影響63
• 3.8 LMWCS對Aβ25-35誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)Caspase-3變化的影響63-65
• 3.9 LMWCS對Aβ25-35誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量變化的影響65-67
• 4 討論67-70
• 5 小結(jié)70-71
• 第三章 LMWCS對Aβ誘導(dǎo)小鼠腦損傷的保護(hù)作用及機(jī)制的研究71-97
• 1 實(shí)驗(yàn)材料71-72
• 1.1 藥品及試劑71
• 1.2 儀器71
• 1.3 工作溶液的配制71-72
• 1.4 動(dòng)物來源72
• 2 實(shí)驗(yàn)方法72-79
• 2.1 動(dòng)物分組和給藥方法72-73
• 2.2 模型制作73
• 2.3 行為學(xué)檢測73-74
• 2.4 小鼠大腦海馬和皮層區(qū)氧化應(yīng)激及能量代謝水平的測定74
• 2.5 小鼠大腦海馬和皮層區(qū)膽堿能功能測定74-75
• 2.6 免疫組織化學(xué)75-78
• 2.7 總蛋白的提取及定量78
• 2.8 Western blot分析78
• 2.9 實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)78-79
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果79-91
• 3.1 LMWCS對Aβ模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力變化的影響79-82
• 3.2 LMWCS對Aβ模型小鼠腦組織氧化應(yīng)激水平變化的影響82-86
• 3.3 LMWCS對Aβ模型小鼠大腦中膽堿酯酶活性變化的影響86-87
• 3.4 免疫組化結(jié)果87-90
• 3.5 Western blot結(jié)果90-91
• 4 討論91-96
• 5 小結(jié)96-97
• 總結(jié)與展望97-99
• 1 論文主要結(jié)論97-98
• 2 論文創(chuàng)新點(diǎn)98
• 3 論文的不足之處98
• 4 展望98-99
• 參考文獻(xiàn)99-114
• 致謝114-115
• 博士期間發(fā)表的論文115-116
• 論文116-130
• 附件130

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

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2 胡金鳳,耿美玉;老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)與硫酸多糖[J];中國藥理學(xué)通報(bào);2003年01期

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本文編號：829386