本文關(guān)鍵詞：線粒體解耦聯(lián)蛋白2與抑郁癥的相關(guān)性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：抑郁癥（depression）是一類以情緒低落、自我評價降低、快感缺失，以及睡眠、飲食和認知異常為主要癥狀的精神疾病。全世界大約有21%的人口受到抑郁癥的影響，預(yù)計到2020年抑郁癥將成為僅次于缺血性心臟病的第二大疾病。抑郁癥涉及多種病理機制，包括：單胺假說、神經(jīng)遞質(zhì)受體假說、神經(jīng)營養(yǎng)因子假說、下丘腦 垂體 腎上腺（hypothalamic-pituitary-adrenocortical，HPA）軸異常、氧化應(yīng)激、炎癥假說等。目前用于抑郁癥的主要治療藥物有：選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑、去甲腎上腺素和多巴胺再攝取抑制劑，以及三環(huán)類抗抑郁藥。但是，上述藥物對約三分之一的重度抑郁癥患者治療學(xué)無效。因此，尋找新的抗抑郁治療靶點、研發(fā)新的治療藥物迫在眉睫。 線粒體解耦聯(lián)蛋白2（uncoupling protein2，UCP2）是位于線粒體內(nèi)膜上的載體蛋白家族成員。UCP2通過發(fā)揮“質(zhì)子漏”的作用消耗線粒體質(zhì)子驅(qū)動力、減少ROS生成；UCP2可促進線粒體生物合成，抑制由線粒體膜電位降低和鈣超載引起的細胞死亡，因而發(fā)揮細胞保護作用。UCP2存在于哺乳類動物腎、胰腺、脾、免疫細胞及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，參與多種代謝過程，如食物攝取，胰島素分泌和免疫應(yīng)答。表達在神經(jīng)細胞的UCP2可調(diào)節(jié)神經(jīng)傳遞、突觸可塑性和神經(jīng)退行性病變等病理生理過程。 本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，UCP2敲除增加小鼠對慢性溫和應(yīng)激（chronic mildstress，CMS）致抑郁的敏感性。然而，UCP2調(diào)節(jié)抑郁癥的具體機制尚不明確。近年來，炎癥反應(yīng)與抑郁癥的相關(guān)性受到研究者的關(guān)注，研究認為，抑郁癥發(fā)病與炎癥反應(yīng)系統(tǒng)激活有關(guān)。NLRP3炎癥小體活化所產(chǎn)生的白介素-1β（interleukin-1beta，IL-1β）在應(yīng)激誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)中扮演了重要角色，線粒體ROS是調(diào)控NLRP3炎癥小體活化的關(guān)鍵信號。線粒體內(nèi)膜上的UCP2蛋白是否通過調(diào)節(jié)ROS生成和氧化應(yīng)激反應(yīng)而參與NLRP3炎癥小體的活化尚未見報道。近年來研究表明，星形膠質(zhì)細胞是調(diào)控ROS生成、氧化應(yīng)激、固有免疫和炎癥反應(yīng)的重要細胞類型和場所，星形膠質(zhì)細胞功能異常在抑郁癥發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。我們推測表達于線粒體內(nèi)膜上的UCP2可能通過調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞NLRP3炎癥小體的激活，參與抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展。 本文應(yīng)用UCP2敲除小鼠，制備CMS抑郁模型，首先觀察UCP2敲除對小鼠抑郁樣行為和神經(jīng)再生的影響，揭示UCP2與抑郁癥的相關(guān)性及機制；其次，檢測星形膠質(zhì)細胞中UCP2和炎癥小體的表達，研究UCP2敲除對星形膠質(zhì)細胞中NLRP3炎癥小體激活的影響，并探討可能的細胞內(nèi)分子機制。 目的：應(yīng)用UCP2敲除小鼠，研究UCP2與抑郁癥的相關(guān)性，闡明UCP2對星形膠質(zhì)細胞NLRP3炎癥小體的調(diào)節(jié)作用及相關(guān)機制。 方法：1.建立CMS致抑郁癥小鼠模型。2.通過糖水偏愛測試（sucrosepreference test）、懸尾試驗（tail suspension test，TST）以及強迫游泳試驗（forcedswimming test，F(xiàn)ST）等行為學(xué)觀察UCP2敲除對小鼠抑郁樣癥狀的影響。3.應(yīng)用免疫組化結(jié)合體視學(xué)計數(shù)，觀察海馬顆粒細胞下層（subgranular zone，SGZ）神經(jīng)干細胞增殖（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU免疫組化）、海馬齒狀回（dentategyrus，DG）Doublecortin（DCX）陽性神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞（glial fibrillary acidicprotein，GFAP）的數(shù)目。4.應(yīng)用免疫熒光的方法觀察UCP2敲除對CMS誘導(dǎo)的海馬ROS生成的影響。5.應(yīng)用Western blotting方法觀察UCP2敲除對CMS誘導(dǎo)的海馬核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（nuclear factor kappa B）亞基p65、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun NH2-terminal kinase，JNK）、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3（nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptor3，NLRP3）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（caspase-1）、白細胞介素-1β（interleukin-1beta，IL-1β）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（78-kilodalton glucose regulated protein，Grp78）、C/EBP同源蛋白（C/EBP-homologous protein，CHOP）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12（caspase-12）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、成纖維細胞生長因子-2（fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2）、環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）表達的影響；應(yīng)用ELISA方法觀察UCP2敲除對CMS誘導(dǎo)的血清IL-1β水平的影響。6.原代培養(yǎng)UCP2+/+和UCP2-/-小鼠皮層、海馬星形膠質(zhì)細胞。應(yīng)用ELISA、Western blotting等方法，觀察UCP2敲除及藥理學(xué)抑制劑對ATP或MSU誘導(dǎo)的原代星形膠質(zhì)細胞NLRP3炎癥小體激活的影響。7.應(yīng)用流式細胞術(shù)、免疫細胞化學(xué)染色、免疫共沉淀、Western blotting方法觀察UCP2敲除對原代星形膠質(zhì)細胞線粒體損傷、ROS生成，以及硫氧還蛋白結(jié)合蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）與NLRP3相互結(jié)合的影響。8.應(yīng)用免疫共沉淀、Western blotting方法觀察ROS清除劑對原代星形膠質(zhì)細胞TXNIP與NLRP3相互結(jié)合、NLRP3炎癥小體激活的影響。9.應(yīng)用Western blotting方法觀察UCP2敲除對原代星形膠質(zhì)細胞JNK磷酸化，以及JNK抑制劑對原代星形膠質(zhì)細胞NLRP3炎癥小體激活的影響。10.應(yīng)用免疫細胞化學(xué)染色、Western blotting等方法觀察轉(zhuǎn)染hUCP2重組質(zhì)粒對原代星形膠質(zhì)細胞線粒體損傷、ROS生成及NLRP3炎癥小體激活的影響。 結(jié)果： 1. UCP2敲除加重CMS所致小鼠的抑郁樣癥狀UCP2敲除加重CMS誘導(dǎo)的小鼠體重和糖水偏愛降低（P 0.05），促進CMS誘導(dǎo)的小鼠體格狀態(tài)下降（P0.05）；基礎(chǔ)狀態(tài)下，UCP2敲除小鼠TST和FST不動時間顯著長于野生型小鼠（P 0.05），UCP2敲除加重CMS誘導(dǎo)的TST和FST不動時間延長的抑郁樣癥狀（P 0.05），TST不動時間較野生型小鼠延長16%，F(xiàn)ST不動時間約為野生型小鼠的兩倍。 2. UCP2敲除加重CMS所致神經(jīng)再生的抑制和星形膠質(zhì)細胞的損傷UCP2敲除加重CMS抑制SGZ細胞增殖的作用（P 0.05），與野生型小鼠相比BrdU+細胞數(shù)減少了17%，DCX+細胞數(shù)減少了33%。UCP2敲除加重CMS所致海馬星形膠質(zhì)細胞的損傷（P 0.05），與野生型小鼠相比GFAP+細胞數(shù)減少了21%。 3. UCP2敲除增加ROS生成及JNK的活性，增強CMS誘導(dǎo)的海馬NLRP3炎癥小體的激活UCP2敲除增加CMS誘導(dǎo)的海馬ROS生成，促進海馬p65表達和JNK磷酸化（P 0.05）；UCP2敲除顯著增加CMS誘導(dǎo)的海馬NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白NLRP3、caspase-1和IL-1β表達（P 0.05），進一步增加小鼠血清IL-1β的水平（P 0.01）。 4. UCP2敲除增強CMS所致海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和營養(yǎng)因子表達的抑制作用基礎(chǔ)狀態(tài)下，兩種基因型小鼠海馬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白蛋白伴侶分子Grp78、效應(yīng)蛋白caspase-12表達無顯著差異（P0.05），UCP2敲除小鼠海馬內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子CHOP表達顯著高于WT鼠（P 0.05）；UCP2敲除顯著促進CMS誘導(dǎo)的海馬Grp78、CHOP、caspase-12表達上調(diào)（P 0.05）；UCP2敲除加重CMS對海馬CREB磷酸化的抑制作用（P 0.05），降低BDNF、FGF-2的表達（P 0.05）。 5. UCP2敲除增強星形膠質(zhì)細胞NLRP3炎癥小體的激活UCP2敲除顯著增加ATP或MSU誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞p65、NLRP3、caspase-1及成熟IL-1β表達（P 0.05）；caspase-1抑制劑z-YVAD-fmk可抑制ATP或MSU誘導(dǎo)的兩種基因型星形膠質(zhì)細胞IL-1β分泌（P 0.01）、逆轉(zhuǎn)UCP2敲除導(dǎo)致的IL-1β水平的增加；UCP2抑制劑Genipin顯著促進MSU誘導(dǎo)的UCP2+/+星形膠質(zhì)細胞NLRP3、caspase-1、IL-1β表達上調(diào)（P 0.05），對UCP2-/-星形膠質(zhì)細胞NLRP3、caspase-1、IL-1β的表達無顯著影響（P0.05）。 6. UCP2敲除增加星形膠質(zhì)細胞ROS生成和JNK磷酸化，加劇NLRP3炎癥小體的激活UCP2敲除顯著增加MSU誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞線粒體損傷和ROS生成（P 0.05）；UCP2敲除促進MSU誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞TXNIP和NLRP3相互結(jié)合（P 0.05）；ROS抑制劑APDC顯著抑制MSU誘導(dǎo)的兩種基因型星形膠質(zhì)細胞TXNIP、NLRP3的相互結(jié)合（P 0.05），抑制NLRP3、caspase-1和IL-1β表達（P 0.05），取消了UCP2敲除所致的促caspase-1活化和IL-1β分泌的作用；UCP2敲除促進MSU誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞JNK磷酸化（P 0.05），JNK抑制劑SP600125顯著抑制MSU誘導(dǎo)的兩種基因型星形膠質(zhì)細胞NLRP3、caspase-1和IL-1β表達上調(diào)（P 0.05）。 7.過表達UCP2減少ROS的生成、抑制星形膠質(zhì)細胞NLRP3炎癥小體的激活過表達UCP2減輕MSU對兩種基因型星形膠質(zhì)細胞線粒體的損傷，顯著減少MSU誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞ROS生成（P 0.05），UCP2+/+星形膠質(zhì)細胞ROS減少了29%，UCP2-/-星形膠質(zhì)細胞ROS減少了44%；過表達UCP2顯著抑制MSU誘導(dǎo)的兩種基因型星形膠質(zhì)細胞NLRP3、caspase-1和IL-1β表達上調(diào)（P 0.05）。 結(jié)論： 1. UCP2敲除通過激活NLRP3炎癥小體加重小鼠抑郁樣癥狀。 2. UCP2敲除加重星形膠質(zhì)細胞NLRP3炎癥小體激活介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。 本文工作的主要創(chuàng)新之處： 1.應(yīng)用CMS抑郁癥動物模型，，研究、闡明UCP2與抑郁癥的相關(guān)性，為抑郁癥的治療提供了新靶標。 2.闡明UCP2通過調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞NLRP3炎癥小體的激活，參與抑郁癥的病理過程。 3.揭示UCP2是NLRP3炎癥小體活化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，為靶向NLRP3炎癥小體治療代謝性炎性疾病提供了新思路。
【關(guān)鍵詞】：抑郁癥 解耦聯(lián)蛋白2 ROS NLRP3炎癥小體 星形膠質(zhì)細胞 神經(jīng)再生
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R749.4
【目錄】：

• 英文縮略詞表6-8
• 中文摘要8-14
• 英文摘要14-20
• 前言20-30
• 材料與方法30-39
• 結(jié)果39-58
• 討論58-63
• 結(jié)論63-65
• 參考文獻65-75
• 綜述75-89
• 參考文獻84-89
• 在讀期間發(fā)表的與本論文相關(guān)的文章89-90
• 致謝90

【共引文獻】

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