發(fā)布時間：2020-11-02 07:38

　　 第一部分Tau蛋白磷酸化對抗細胞凋亡及其機制的研究 神經(jīng)原纖維纏結(neurofibrillary tangles, NFTs)是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)和tau相關疾病患者腦中典型的病理學特征之一,NFTs的主要成分是異常過度磷酸化的微管相關蛋白tau。AD和tau相關疾病患者腦內大多數(shù)含有NFTs的神經(jīng)元盡管長期持續(xù)處在促凋亡的環(huán)境中卻不發(fā)生凋亡而是進行慢性的退行性變性死亡,目前對此現(xiàn)象的機制仍不清楚。本研究在兩種細胞株鼠成神經(jīng)瘤(mouse Neuroblastoma 2a, N2a)細胞和人胚腎(Human Embryonic Kidney 293, HEK293)細胞、大鼠和tau轉基因小鼠中探討神經(jīng)細胞逃逸凋亡及其機制。結果顯示:(1)細胞中過度表達微管相關蛋白tau顯著抵抗凋亡誘導劑誘導的細胞凋亡,并且同時伴隨有微管相關蛋白tau的過度磷酸化和糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinase 3, GSK-3)的酶活性升高;(2)在過度表達微管相關蛋白tau的細胞中過度表達GSK-3不僅完全抑制了GSK-3的促凋亡作用,并且使細胞抵抗凋亡誘導劑誘導的細胞凋亡;(3)細胞、大鼠和tau轉基因小鼠中過度磷酸化的微管相關蛋白tau與caspase-3活性片段和(或)濃縮/碎裂的細胞核不存在共定位,去磷酸化的tau蛋白與caspase-3活性片段和(或)濃縮/碎裂的細胞核存在共定位;(4)與微管相關蛋白tau過度磷酸化相伴隨的是β-catenin的磷酸化水平降低、β-catenin的水平升高和細胞核轉位增加;(5)采用siRNA方法降低β-catenin的水平顯著降低微管相關蛋白tau的抗凋亡作用;β-catenin的過度表達抗凋亡誘導劑誘導的細胞凋亡。綜上所述,本實驗獨創(chuàng)地提出了微管相關蛋白tau過度磷酸化的抗凋亡作用:tau蛋白過度磷酸化抑制GSK-3β對β-catenin的磷酸化、升高β-catenin的水平和促進β-catenin的細胞核轉位從而使細胞抵抗凋亡。本研究結果顯示微管相關蛋白tau過度磷酸化使細胞逃逸滅絕性的凋亡性死亡,為揭示AD和tau相關疾病患者腦中神經(jīng)退行性變性的本質提供了實驗證據(jù)。 第二部分在N2a細胞中過度表達dishevelled-1蛋白抑制渥曼青霉素誘導的細胞骨架蛋白的過度磷酸化 神經(jīng)原纖維纏結(neurofibrillary tangles, NFTs)是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的特征性病理學特征之一,NFTs主要是由成對的螺旋絲(paired helical filaments, PHF)組成,而構成PHF的主要蛋白組分是過度磷酸化的微管相關蛋白tau。另外,異常過度磷酸化的神經(jīng)細絲也是NFTs的組成成分。研究顯示W(wǎng)nt信號途徑在AD的發(fā)病中起著重要的作用,并且過度表達dishevelled-1 (DVL-1)蛋白可以模擬Wnt信號。目前,DVL-1蛋白對神經(jīng)細絲磷酸化的影響以及對神經(jīng)細胞中微管相關蛋白tau磷酸化的影響尚未見報道。在本實驗中,為了探討DVL-1蛋白對阿爾茨海默病樣骨架蛋白磷酸化的影響,首先,用渥曼青霉素處理鼠成神經(jīng)瘤細胞2a (mouse Neuroblastoma 2a,N2a)建立細胞骨架蛋白異常過度磷酸化的細胞模型;然后,在N2a細胞中轉染攜帶DVL-1基因的真核表達質粒過度表達DVL-1蛋白,用渥曼青霉素處理細胞后,采用免疫印跡和免疫熒光技術檢測神經(jīng)細絲和微管相關蛋白tau的磷酸化。結果顯示:神經(jīng)細絲在SMI31位點和tau蛋白在PHF-1位點的磷酸化在渥曼青霉素處理后1 h和3 h增強,6 h恢復至正常水平;神經(jīng)細絲和微管相關蛋白tau磷酸化的高峰分別在渥曼青霉素處理后1 h和3 h;過度表達DVL-1蛋白顯著抑制渥曼青霉素誘導的神經(jīng)細絲在SMI31和SMI32位點和微管相關蛋白tau在PHF-1 (Ser-396/404)、M4 (Thr-231/Ser-235)和Tau-1 (Ser-198/199/202)位點的過度磷酸化。綜上所述,我們的研究發(fā)現(xiàn):在N2a細胞中過度表達DVL-1蛋白能夠顯著抑制渥曼青霉素誘導的神經(jīng)細絲和微管相關蛋白tau的過度磷酸化。 第三部分DVL-1 cDNA重組質粒在N2a細胞中的瞬時表達 目的將鼠dishevelled-1 (DVL-1) cDNA重組質粒轉染到培養(yǎng)的鼠成神經(jīng)瘤細胞N2a (mouse Neuroblastoma 2a),建立瞬時表達系統(tǒng),為研究Wnt信號途徑在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)發(fā)病中的作用提供實驗基礎。方法用常規(guī)分子生物學方法擴增和純化DVL-1 cDNA重組質粒,用紫外分光技術檢測純化質粒的純度;用脂質體介導法將重組質粒轉染入培養(yǎng)的鼠成神經(jīng)瘤細胞N2a,用免疫印跡和免疫熒光方法從蛋白質水平檢測轉染和表達效果。結果質粒酶切電泳結果顯示:鼠DVL-1 cDNA重組質粒PCS2+MT-MDVL1擴增和純化成功,純度達到要求;免疫印跡和免疫熒光結果顯示鼠DVL-1 cDNA重組質粒在鼠成神經(jīng)瘤細胞N2a中獲得表達,基因轉染和表達率為57.6%。結論成功將鼠DVL-1 cDNA重組質粒轉染到培養(yǎng)的鼠成神經(jīng)瘤細胞N2a中,并獲得瞬時表達。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2007
【中圖分類】：R749.16
【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
第一部分 Tau 蛋白磷酸化對抗細胞凋亡及其機制的研究
    前言
    材料與方法
    結果
    討論
    小結
    創(chuàng)新點
    參考文獻
第二部分 在N2a 細胞中過度表達dishevelled-1 蛋白抑制渥曼青霉素誘導的細胞骨架蛋白的過度磷酸化
    前言
    材料與方法
    結果
    討論
    小結
    創(chuàng)新點
    參考文獻
第三部分 DVL-1 cDNA 重組質粒在N2a 細胞中的瞬時表達
    前言
    材料與方法
    結果
    討論
    小結
    創(chuàng)新點
    參考文獻
綜述
附錄:博士期間發(fā)表文章
致謝

【參考文獻】

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1 陳曉釬,烏維寧,于常海;14-3-3:保護性信號轉導調節(jié)蛋白[J];生理科學進展;2004年03期

2 徐雅飛,張永杰,王建枝;多肽脯氨酰順反異構酶與阿爾茨海默病[J];生命的化學;2004年04期

本文編號：2866759