糖尿病相關(guān)認(rèn)知下降(diabetes-associated cognitive decline, DACD),也被稱為糖尿病腦病,是糖尿病在腦部的一種慢性進(jìn)展性并發(fā)癥,臨床表現(xiàn)為逐漸出現(xiàn)的認(rèn)知功能下降。據(jù)統(tǒng)計(jì),2030年成人糖尿病的全球患病率很可能從2010年的2.85億增長到4.39億,將近是2010年的2倍。中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會“中國糖尿病和代謝綜合征研究組"2010年在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》發(fā)表的關(guān)于我國糖尿病患病率調(diào)查的結(jié)果顯示,我國20歲以上人群中糖尿病的患病率已達(dá)9.7%,總患病人數(shù)達(dá)九千兩百萬以上,專家估計(jì)70歲以上年齡組患病率超過20%,形勢十分嚴(yán)峻。目前DACD缺乏統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn),尚無確切的患病率統(tǒng)計(jì),但必將隨老齡化社會的來臨以及糖尿病患病率的增高而增高。認(rèn)知功能損傷將給患者的生活帶來不便,甚至使其喪失生活自理能力,給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān),因而DACD的防治已成為全世界亟待解決的問題。目前對DACD病機(jī)的研究涉及葡萄糖毒性、胰島素信號障礙、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、炎癥、氧化應(yīng)激損傷、血管病變及下丘腦-垂體-腎上腺軸異常等方面,但確切機(jī)制仍不清楚。而對本病的治療還處于試驗(yàn)階段,尚無公認(rèn)的治療措施。 蛋白質(zhì)是生命活動的直接執(zhí)行者,細(xì)胞中各種病理改變的發(fā)生無不與蛋白質(zhì)異常有關(guān)。但目前以單個蛋白質(zhì)為對象的研究方式已無法滿足人類對生命活動全面深入認(rèn)識的需求。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)作為系統(tǒng)生物學(xué)時代最熱點(diǎn)的研究領(lǐng)域之一,是對一個基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)在整體水平上的大規(guī)模研究,它通過一系列高分辨率、高通量的蛋白質(zhì)分離、鑒定技術(shù),使與疾病相關(guān)的特異蛋白分子一次性、全面的暴露出來,加快了對疾病病理改變的認(rèn)識。目前關(guān)于糖尿病認(rèn)知損傷的研究越來越多,但蛋白質(zhì)組學(xué)方面的分析還很少。海馬與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān),也是腦組織中最易受損的部位之一。海馬損傷被證明是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)患者腦部早期病變。對DACD海馬蛋白質(zhì)組學(xué)的研究將可能揭示糖尿病認(rèn)知損傷的重要機(jī)制。 糖尿病在中醫(yī)學(xué)中屬于“消渴”病范疇。記憶力降低等認(rèn)知功能減退的表現(xiàn),屬于中醫(yī)學(xué)“健忘”、“呆病”范疇。《圣濟(jì)總錄》中已有“消渴日久,健忘怔忡”等糖尿病認(rèn)知損害的癥狀記載。因此,DACD可認(rèn)為是消渴病合并健忘或呆病。消渴病機(jī)以陰虛為本,燥熱為標(biāo),病變的臟腑主要在肺、胃、腎。但除此三臟之外,脾陰虛在消渴發(fā)生發(fā)展過程中的作用也不可忽視。早在《素問》中即有甘美多肥之食化熱耗傷脾陰而發(fā)消渴的論述。另外郁怒化熱、思慮過度皆可暗耗脾陰而致消渴。此外,脾為后天之本,“臟真濡于脾”,五臟六腑陰血津液的補(bǔ)充無不有賴于脾。脾陰與全身陰液在生理上息息相通,病理上相互影響。脾陰足自然能不斷補(bǔ)充五臟之陰,使肺、胃、腎之陰虧逐漸改善而漸復(fù)；然脾陰不足,則三臟之陰無以復(fù),導(dǎo)致病情加重。脾陰耗傷,脾運(yùn)失健,日久氣血化生不足,痰瘀阻塞腦竅,導(dǎo)致腦髓失養(yǎng),神明失用而發(fā)呆病。從治療角度,消渴病以陰虛為本,理當(dāng)滋陰為要。而脾為太陰,乃三陰之長,故治療陰虛當(dāng)以滋養(yǎng)脾陰為主,脾陰充足,自能灌溉諸臟腑,而使疾病出現(xiàn)向愈之機(jī)。 滋補(bǔ)脾陰方藥(ZiBu PiYin Recipe, ZBPYR)源自清代醫(yī)家吳澄《不居集》中的資成湯,經(jīng)戰(zhàn)麗彬教授據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)加減而成。全方以培補(bǔ)后天、滋補(bǔ)脾陰為原則,既能滋補(bǔ)脾陰而不滯膩,又兼化痰通瘀、安神益智之功效,是針對糖尿病認(rèn)知損傷中的脾陰虛損、痰瘀阻竅病機(jī)治療的良好方劑。既往研究顯示ZBPYR能夠通過多種途徑顯著改善老齡及癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。而ZBPYR對DACD的作用還不清楚。本研究以ZBPYR對DACD大鼠進(jìn)行干預(yù),并應(yīng)用基于熒光差異凝膠電泳(DIGE)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法,對DACD大鼠的海馬進(jìn)行研究,希望從組織整體蛋白質(zhì)水平揭示DACD可能的病變機(jī)制,并尋找ZBPYR的作用靶點(diǎn),以期為DACD的防治提供有益參考。 目的：1.觀察ZBPYR對DACD動物模型認(rèn)知功能的影響；2.尋找DACD大鼠海馬蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)蛋白,以揭示疾病特異靶分子,并觀察ZBPYR干預(yù)對DACD大鼠海馬蛋白質(zhì)組的影響,以發(fā)現(xiàn)ZBPYR作用靶蛋白,為DACD的防治提供線索；3.明確蛋白質(zhì)組結(jié)果的可靠性,并初步分析差異表達(dá)蛋白質(zhì)豐度的改變與mRNA水平變化的關(guān)系。 方法：1.實(shí)驗(yàn)動物分為對照組、糖尿病組和治療組。采用高脂飼養(yǎng)復(fù)合小劑量STZ(鏈脲佐菌素)腹腔注射法建立T2DM動物模型,通過監(jiān)測隨機(jī)血糖(RBG)、測定空腹血清胰島素(FSI)、口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)和胰島素耐量試驗(yàn)(ITT)對T2DM模型進(jìn)行評估,以水迷宮、跳臺實(shí)驗(yàn)觀察動物的認(rèn)知功能和ZBPYR的干預(yù)效果；2.采用DIGE方法對DACD大鼠海馬蛋白質(zhì)進(jìn)行分離,以DIGE專用軟件對凝膠掃描圖進(jìn)行分析,獲得差異表達(dá)蛋白點(diǎn)；3.應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF MS)和生物信息學(xué)手段對獲得的感興趣差異表達(dá)蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定,以揭示可能參與的分子機(jī)制；4.以Western blot在蛋白水平上對蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果進(jìn)行可靠性驗(yàn)證,并應(yīng)用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)初步分析差異蛋白質(zhì)豐度改變與mRNA水平變化的關(guān)系。 結(jié)果：1.高脂飼料喂養(yǎng)4周后,糖尿病模型大鼠較對照組體重明顯增加,形成肥胖。STZ注射后,糖尿病模型大鼠出現(xiàn)了多飲、多食、多尿等癥狀,RBG和FSI顯著升高,葡萄糖灌胃后OGTT各點(diǎn)血糖值均明顯高于對照組p0.05),ITT顯示血糖下降速度較對照組緩慢,以上數(shù)據(jù)提示T2DM模型形成。ZBPYR使治療組大鼠糖尿病癥狀改善,飲食、飲水量減少,RBG有降低趨勢,但除飲食量外均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。行為學(xué)測試發(fā)現(xiàn)糖尿病組動物的學(xué)習(xí)記憶成績顯著差于對照組(p0.05),而治療組大鼠學(xué)習(xí)記憶成績與對照組水平接近,明顯好于糖尿病組p0.05)；2.經(jīng)DIGE分析,糖尿病組與對照組比較共發(fā)現(xiàn)了13個顯著差異表達(dá)蛋白點(diǎn)；治療組與糖尿病組比較共發(fā)現(xiàn)了12個顯著差異表達(dá)蛋白點(diǎn)；治療組與對照組比較只發(fā)現(xiàn)了6個顯著差異表達(dá)蛋白點(diǎn)；3.經(jīng)MALDI-TOF/TOF MS分析和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫檢索,共有9個差異表達(dá)蛋白質(zhì)被成功鑒定,分別是PDHE1α、CI-42kD、MATPSα、DRP-2、α-tubulin2、p34-ARC、G6PD、GSTM1-1和Stxbpl,其功能主要涉及能量代謝、細(xì)胞骨架動態(tài)變化和氧化應(yīng)激；4.蛋白PDHE1α、DRP-2和G6PD的Western blot分析結(jié)果與蛋白質(zhì)組分析結(jié)果有良好的一致性；DRP-2和G6PD的mRNA表達(dá)變化趨勢與蛋白質(zhì)水平變化趨勢相一致,糖尿病組表達(dá)水平較其它兩組為低,但都未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05); PDHE1α的mRNA水平三組間非常接近,無明顯差別。 結(jié)論：1.在高脂飼養(yǎng)復(fù)合小劑量STZ腹腔注射法建立的T2DM動物模型基礎(chǔ)上可以成功形成DACD。ZBPYR可顯著減輕DACD大鼠的學(xué)習(xí)記憶損傷；2.DIGE能夠成功用于DACD及ZBPYR干預(yù)后海馬的比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析。DIGE發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)點(diǎn)很可能是與DACD發(fā)病相關(guān)的疾病特異分子或ZBPYR作用的靶蛋白；3.鑒定的9個蛋白質(zhì)分子參與的細(xì)胞功能提示,DACD大鼠海馬中可能存在細(xì)胞能量代謝、細(xì)胞骨架動態(tài)變化和氧化應(yīng)激環(huán)節(jié)的異常而損傷認(rèn)知功能,ZBPYR可作用于多靶點(diǎn)對病變進(jìn)行修復(fù),從而改善認(rèn)知；4.Western blot分析證實(shí)了蛋白質(zhì)組技術(shù)的可靠性。qRT-PCR結(jié)果提示蛋白質(zhì)表達(dá)水平的改變可能不完全源于mRNA的變化,很可能也與蛋白質(zhì)的翻譯后修飾或降解有關(guān)。
【學(xué)位單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2011
【中圖分類】：R285.5;R749.24
【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 糖尿病相關(guān)認(rèn)知下降大鼠模型的建立及滋補(bǔ)脾陰方藥的干預(yù)作用
    （一） 前言
    （二） 材料和方法
    （三） 結(jié)果
    （四） 討論
    （五） 結(jié)論
    （六） 參考文獻(xiàn)
第二章 糖尿病相關(guān)認(rèn)知下降大鼠海馬蛋白質(zhì)組差異表達(dá)分析及滋補(bǔ)脾陰方藥的影響
    （一） 前言
    （二） 材料和方法
    （三） 結(jié)果
    （四） 討論
    （五） 結(jié)論
    （六） 參考文獻(xiàn)
第三章 糖尿病相關(guān)認(rèn)知下降大鼠海馬認(rèn)知損傷相關(guān)蛋白及滋補(bǔ)脾陰方藥作用靶蛋白的鑒定
    （一） 前言
    （二） 材料和方法
    （三） 結(jié)果
    （四） 討論
    （五） 結(jié)論
    （六） 參考文獻(xiàn)
第四章 差異表達(dá)蛋白的驗(yàn)證和相關(guān)基因mRNA水平檢測
    （一） 前言
    （二） 材料和方法
    （三） 結(jié)果
    （四） 討論
    （五） 結(jié)論
    （六） 參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述
    （一） 正文
    （二） 參考文獻(xiàn)
附錄
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2861744