本文關(guān)鍵詞：Aβ調(diào)控自噬通量的效果及其分子機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一種老年人中常見的以認(rèn)知障礙為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD隱匿起病,發(fā)病機(jī)制至今仍未闡明。近年來,由于自噬障礙導(dǎo)致的AD中蛋白質(zhì)修飾和降解異常成為新的研究熱點(diǎn)。在AD典型病理特征出現(xiàn)之前,患者腦內(nèi)已經(jīng)有大量的自噬體存在,提示自噬可能是AD患者腦內(nèi)的早期病理反應(yīng)。本研究旨在篩選和建立穩(wěn)定表達(dá)自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein1light chain3, LC3)的細(xì)胞系,并用于研究Aβ調(diào)控細(xì)胞自噬通量(autophagy flux)的效果,及其對細(xì)胞生長的作用和可能的機(jī)制。 方法：(1)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)EGFP-LC3的HEK293細(xì)胞系。本文通過比較細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和LC3蛋白表達(dá)水平,從6種細(xì)胞中篩選用于建系的細(xì)胞種類。摸索并確定遺傳霉素(geneticin, G418)的濃度,轉(zhuǎn)染EGFP-LC3表達(dá)質(zhì)粒,對細(xì)胞進(jìn)行壓力選擇性篩選。(2)建立Aβ誘導(dǎo)自噬的細(xì)胞模型。通過熒光顯微鏡觀察,明確細(xì)胞內(nèi)Ap過量表達(dá)以及細(xì)胞外Ap多肽處理這兩種途徑誘導(dǎo)EGFP-LC3-HEK293穩(wěn)定細(xì)胞自噬的效果,并進(jìn)一步探討劑量、時(shí)間以及Ap聚集狀態(tài)與自噬的關(guān)系。用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)確認(rèn)自噬體的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)特征。(3)Ap誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的初步機(jī)制。以10μmol/L的Aβ40、Aβ42全長肽以及疏水性氨基酸含量不同的4種Ap截短形式(Aβ1-11、Aβ12-24、Aβ25-35和Aβ35-42)分別處理EGFP-LC3穩(wěn)定細(xì)胞24h,用熒光顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)LC3的熒光斑點(diǎn)數(shù)；用Western blot檢測LC3BII/LC3BI、 p62、 HSP70及HSP90表達(dá)量的變化；用MTT檢測特定Ap誘導(dǎo)細(xì)胞自噬過程中伴隨的細(xì)胞活力的改變情況。 結(jié)果：(1)成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)EGFP-LC3的細(xì)胞系。用700μg/mL的G418加壓篩選6周,獲得EGFP-LC3陽性率為100%的穩(wěn)定細(xì)胞系EGFP-LC3-HEK293。(2)成功建立Ap誘導(dǎo)自噬的細(xì)胞模型。細(xì)胞內(nèi)Ap過量表達(dá)以及細(xì)胞外Ap多肽處理這兩種途徑均可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的LC3熒光斑點(diǎn),并且具有劑量依賴性、時(shí)間依賴性以及二級結(jié)構(gòu)依賴性。確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用的條件為：聚合24h的Ap寡聚體以10μmol/L的濃度處理細(xì)胞24h。在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平,TEM證實(shí)了Ap可以誘導(dǎo)自噬體的出現(xiàn)。(3)Ap誘導(dǎo)自噬的機(jī)制研究。首先,熒光顯微鏡結(jié)果顯示,不同形式Aβ肽均可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬激活,并且Aβ25-35、 Aβ40和Aβ42誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)LC3熒光斑點(diǎn)的效果更明顯。誘導(dǎo)自噬的效果與疏水性氨基酸含量無關(guān)。其次,Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,Aβ42組及陽性對照組中LC3BII均有所增加,LC3BII/LC3BI的比值伴隨細(xì)胞白噬增強(qiáng)而增加,提示LC3酯化程度的加強(qiáng)。同時(shí),伴隨自噬的激活,p62蛋白的表達(dá)量相應(yīng)減少,提示自噬促進(jìn)其降解。經(jīng)巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1,BafA1)阻斷自噬-溶酶體形成的環(huán)節(jié)后,與空白對照組相比,LC3BII表達(dá)水平以及LC3BII/LC3BI的比值(p0.01)增加更明顯,同時(shí)p62的表達(dá)水平未見降低。與Aβ42處理組相比,AP42+BafA1組中LC3BII表達(dá)水平、LC3BII/LC3BI的比值(p0.01)以及p62表達(dá)水平(p0.05)明顯增加。同樣,與血清去除組相比,血清去除+Baf Al組中LC3BII表達(dá)水平、LC3BII/LC3BI的比值(p0.05)以及p62表達(dá)水平(p0.01)也明顯增加。在熱休克蛋白應(yīng)激方面,與空白組相比,Aβ42組及血清去除組中HSP90表達(dá)量增加,而HSP70表達(dá)量減弱。最后,MTT結(jié)果顯示,與Aβ40相比,Aβ42處理后伴隨自噬表現(xiàn)出的細(xì)胞毒性更強(qiáng)(p0.05)。 結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了EGFP-LC3-HEK293穩(wěn)定細(xì)胞系,在細(xì)胞水平證實(shí)了Aβ誘導(dǎo)自噬的效應(yīng)和機(jī)制,并證明Aβ誘導(dǎo)自噬與其細(xì)胞毒性相關(guān)。為進(jìn)一步探討Aβ自噬在AD發(fā)病機(jī)制和診治策略中的作用奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：β-淀粉樣肽(Aβ) 自噬 阿爾茨海默病(AD) 微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(MAPLC3 LC3) 自噬小體
【學(xué)位授予單位】：北京交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R749.16
【目錄】：

• 致謝5-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 1 引言12-16
• 1.1 研究背景和意義12
• 1.2 自噬的研究現(xiàn)狀及問題12-15
• 1.2.1 自噬的一般機(jī)制12-14
• 1.2.2 AD與自噬14-15
• 1.3 研究策略與創(chuàng)新點(diǎn)15-16
• 2 材料16-21
• 2.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞系16
• 2.2 工具酶與試劑盒16
• 2.3 要試劑及耗材16-17
• 2.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器17-18
• 2.5 主要溶液配制18-21
• 3 方法21-29
• 3.1 技術(shù)路線21
• 3.2 質(zhì)粒的鑒定21-22
• 3.3 細(xì)胞培養(yǎng)22-23
• 3.3.1 原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)22
• 3.3.2 傳代細(xì)胞培養(yǎng)22-23
• 3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定細(xì)胞系的建立23-24
• 3.5 Aβ寡聚體的制備24
• 3.6 SDS-PAGE24
• 3.7 Aβ42樣品透析24-25
• 3.8 Aβ42的CD譜分析25
• 3.9 自噬的誘導(dǎo)及鑒定25
• 3.10 免疫熒光25-26
• 3.11 溶酶體示蹤26
• 3.12 細(xì)胞總蛋白的提取與測定26
• 3.13 Western blot檢測LC3B、p62及HSP70/90表達(dá)26-27
• 3.14 MTT法檢測細(xì)胞活力27
• 3.15 TEM確認(rèn)自噬超微結(jié)構(gòu)27
• 3.16 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析27-29
• 4 結(jié)果29-52
• 4.1 質(zhì)粒的雙酶切鑒定29
• 4.2 細(xì)胞的培養(yǎng)與選擇29-33
• 4.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)29-30
• 4.2.2 細(xì)胞的選擇30-33
• 4.3 穩(wěn)定表達(dá)EGFP-LC3的HEK293細(xì)胞系的建立及鑒定33-34
• 4.4 圓二色譜法分析Aβ42的二級結(jié)構(gòu)34-35
• 4.5 Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬35-46
• 4.5.1 細(xì)胞內(nèi)Aβ過量表達(dá)及外源Aβ誘導(dǎo)細(xì)胞自噬35-36
• 4.5.2 劑量依賴性36-38
• 4.5.3 時(shí)間依賴性38
• 4.5.4 Aβ不同聚合時(shí)間誘導(dǎo)細(xì)胞自噬38-40
• 4.5.5 TEM檢測自噬小體超微結(jié)構(gòu)40-42
• 4.5.6 截短的Aβ肽誘導(dǎo)EGFP-LC3穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞的自噬42-45
• 4.5.7 巴佛洛霉素A1增強(qiáng)Aβ誘導(dǎo)自噬45-46
• 4.6 溶酶體示蹤與檢測46-48
• 4.7 Western blot檢測48-50
• 4.7.1 Western blot檢測LC3BII/I和p62的變化48-49
• 4.7.2 Western blot檢測HSP70/HSP90的變化49-50
• 4.8 MTT檢測Aβ誘導(dǎo)自噬后的細(xì)胞活性50-52
• 5 討論52-55
• 6 結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-59
• 附錄59-61
• 碩士期間發(fā)表論文情況61-62
• 作者簡歷62-64
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集#@@

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張瑩;郭舒涵;房芳;何金生;彭向雷;;自噬穩(wěn)態(tài)調(diào)控與阿爾茨海默病防治策略[J];生命科學(xué);2014年04期

2 劉詩o

本文編號：278637