【摘要】：酒精濫用一直是西方國家導致嚴重肝臟疾病的首要因素,在我國,隨著人群中嗜酒者比例的不斷增長,酒精已成為繼病毒性肝炎后導致肝損害的第二大病因。酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)具體發(fā)病機制仍未完全清楚,目前認為ALD是在個體遺傳易感性基礎上,乙醇通過本身或其代謝產(chǎn)物乙醛的直接毒性、氧化應激、免疫介導、細胞因子與內(nèi)毒素以及病毒疊加等機制引起肝細胞損傷。 我們前期通過建立慢性酒精性肝病大鼠模型,發(fā)現(xiàn)慢性酒精給予可引起大鼠原代肝細胞游離鈣離子濃度(cytoplasmic free Ca2+concentration,[Ca2+]i)顯著增加,線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondria permeability transition pore, MPTP)持續(xù)開放、跨膜電位△Ψm下降,誘導肝細胞的損傷和/或凋亡,提示肝細胞鈣超載是乙醇誘導肝臟損傷的重要途徑。乙醇誘導肝細胞[Ca2+]cyt升高的機制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)乙醇可以通過抑制1,4,5-三磷酸肌醇受體(Inositol trisphosphate receptor, IP3R)降解途徑致其表達量增高,增強激素誘導的Ca2+自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放；慢性乙醇給予后氧化應激增強,細胞膜通透性增加,膜離子轉(zhuǎn)運蛋白功能紊亂,使得胞外Ca2+內(nèi)流增多；同時乙醇可以誘導肝細胞線粒體PTP呈高導性持續(xù)開放,使線粒體Ca2+大量外流,加重肝細胞鈣超載。但是仍然存在以下問題尚未解決：由IP3R引起的胞質(zhì)中Ca2+升高僅是一個瞬時變化,維持細胞鈣超載的持續(xù)性因素尚不清楚；乙醇誘導后胞膜哪些離子轉(zhuǎn)運蛋白功能紊亂介導了胞外Ca2+內(nèi)流仍不能確定；很多研究表明胞內(nèi)[Ca2+]cyt持續(xù)升高所致的線粒體Ca2+代償性蓄積,是線粒體PTP高導性開放的重要原因,但前期胞內(nèi)[Ca2+]i升高的途徑仍未明確。鈣池操縱的Ca2+通道(store-operated Ca2+channels, SOCs)是包括肝細胞在內(nèi)的非興奮細胞Ca2+內(nèi)流的主要通道,在Ca2+參與的信號傳導、細胞增殖、細胞凋亡等多種細胞活動中發(fā)揮著不可替代的作用。肝細胞中只有一種高Ca2+選擇性SOC,被ER內(nèi)腔Ca2+濃度降低激活而開放,生理作用在于補充ER的Ca2+而避免鈣庫Ca2+耗竭。間質(zhì)相互作用因子1(stromal interaction molecule1, STIM1)及鈣釋放激活鈣通道蛋白1(Calcium release-activated calcium channel protein1, Orial)是目前已確定的肝細胞SOCs組成蛋白,STIM1為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+濃度感受器,Orail是SOCs在細胞膜上的孔蛋白。 基于乙醇引起肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+的實驗觀察及SOCs由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔Ca2+濃度下降激活的生物學特性,本研究提出以下假設：SOCs可能參與乙醇誘導肝細胞鈣超載病理過程,其作用可能是在乙醇誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+瞬時釋放后,維持肝細胞胞外Ca2+持續(xù)內(nèi)流,從而使胞內(nèi)Ca2+濃度達到細胞損傷的程度。本研究通過建立體外乙醇誘導肝細胞慢性損傷模型及體內(nèi)慢性ALD大鼠模型,利用通道阻斷劑鑒定SOCs在乙醇誘導胞外Ca2+內(nèi)流及相關(guān)損傷中可能發(fā)揮的作用；檢測乙醇刺激對體內(nèi)外肝細胞SOCs通道蛋白分子STIM1、Orail表達量及定位的影響,并檢測SOCs通道蛋白STIM1、OrailRNA干擾對乙醇誘導肝細胞[Ca2+]i增高及相關(guān)損傷的影響,探討SOCs發(fā)揮作用的具體途徑。本研究分三個部分： 一、鈣池操縱鈣離子通道參與乙醇誘導肝細胞Ca2+濃度增高及肝細胞損傷 目的 觀察體外乙醇慢性刺激對人HepG2細胞Ca2+濃度、細胞存活率及細胞損傷影響,通過EGTA、2-APB、La3+對上述過程的干預,分析胞外Ca2+及鈣池操縱的鈣離子通道在慢性乙醇誘導肝細胞Ca2+濃度增高及肝細胞損傷中的作用。 方法 1.細胞培養(yǎng)：人HepG2肝癌細胞株,高糖DMEM+10%胎牛血清常規(guī)培養(yǎng),當達到80-90%融合時傳代,實驗采用第4-8代細胞。 2.實驗分組：實驗分為正常對照組(PBS刺激),乙醇慢性刺激組(濃度梯度分別為25mM、50mM、100mM、200mM、400mM、800mM,刺激24小時)；乙醇+EGTA處理組(EGTA濃度梯度分別為0.25mM、0.5mM、1mM),乙醇+2-APB處理組(2-APB濃度梯度分別為25gM、50gM、75gM、100gM),乙醇+La3+處理組(La3+濃度梯度分別為0.1gM、1gM、10μM) 3.肝細胞[Ca2+]cyt檢測：Fluo-3/AM或Fura-2/AM標記肝細胞Ca2+,流式細胞儀檢測平均單個肝細胞[Ca2+]cyt,光譜掃描多功能酶標儀檢測總肝細胞[Ca2+]cyt。 4.細胞存活率檢測：采用臺盼藍據(jù)染和CCK-8試劑盒兩種方法觀察乙醇刺激及EGTA、2-APB、La3+干預對HepG2細胞存活的影響。 5.肝細胞損傷檢測：收集各組肝細胞培養(yǎng)上清,全自動生化分析儀檢測乙醇刺激及EGTA、2-APB、La3+干預對ALT、AST漏出含量的影響。 結(jié)果 1.乙醇刺激對HepG2細胞存活率及細胞損傷影響：0-800mM乙醇(刺激24h)濃度依賴性降低HepG2細胞存活率,增高細胞培養(yǎng)基上清ALT、AST漏出量。200mM乙醇刺激時HepG2細胞存活率為65.28±7.38%(臺盼藍)及67.83±4.41%(CCK8),因此選擇200mM乙醇作為下一步的刺激實驗濃度。 2.乙醇刺激對HepG2細胞Ca2+濃度的影響：0-400mM乙醇濃度依賴性增高HepG2細胞胞漿游離Ca2+濃度,且光譜掃描多功能酶標儀檢測總肝細胞[Ca2+.]cyt水平高于流式細胞儀檢測的平均單個肝細胞[Ca2+]i水平。 3. EGTA、2-APB、La3+干預對HepG2細胞Ca2+濃度的影響：EGTA、2-APB、La3+干預濃度依賴性降低200mM乙醇刺激HepG2細胞增高的[Ca2+]i水平,三者之間無統(tǒng)計學差異。 4. EGTA、2-APB、La3+干預對HepG2細胞存活率及細胞損傷影響：與200mM乙醇刺激組相比,EGTA、2-APB、La3+干預濃度依賴性增高HepG2細胞存活率,降低細胞培養(yǎng)基上清ALT、AST漏出量,三者之間無統(tǒng)計學差異。 結(jié)論 1.體外乙醇慢性刺激濃度依賴性增高HepG2細胞Ca2+濃度并加重細胞損傷,可作為乙醇刺激肝細胞損傷的體外研究模型。 2.胞外Ca2+內(nèi)流參與乙醇慢性刺激HepG2細胞Ca2+濃度增高,由于EGTA、2-APB、La3+三者之間的干預效應無統(tǒng)計學差異,因此通過鈣池操縱的鈣離子通道的胞外Ca2+內(nèi)流可能是其中的主要成分,且鈣池操縱的鈣離子通道介導的胞外Ca2+內(nèi)流參與乙醇所致的肝細胞損傷。 3. EGTA、2-APB、La3+干預不能完全抑制乙醇所致的HepG2細胞Ca2+濃度增高,因此除胞外Ca2+內(nèi)流外,胞內(nèi)鈣庫Ca2+釋放也參與乙醇刺激所致的HepG2細胞Ca2+濃度增高及細胞損傷。 二、體內(nèi)外慢性乙醇刺激誘導肝細胞鈣池操縱鈣離子通道分子表達增高 目的 檢測體外慢性乙醇刺激對HepG2細胞鈣池操縱鈣離子通道蛋白主要組成分子STIM1及Orail表達的影響,檢測STIM1及Orail在慢性酒精性肝病大鼠模型肝組織中的表達、定位,分析STIM1及Orail與肝組織損傷的關(guān)系,探討SOCs參與乙醇誘導肝細胞鈣超載及相關(guān)損傷的具體途徑。 方法 1.體外實驗：人HepG2細胞株,高糖DMEM+10%胎牛血清常規(guī)培養(yǎng),當達到80-90%融合時傳代,種入6孔板,細胞貼壁后進行刺激。細胞分為正常對照組(PBS刺激),乙醇慢性刺激24h組、48h組、72h組。 2.體內(nèi)實驗：40只成年雄性Wistar大鼠正常飼養(yǎng)1周后隨機分為正常對照組及ALD模型組。模型組橄欖油拌平衡飼料喂養(yǎng)大鼠的基礎上,大鼠給予每日兩次白酒胃內(nèi)灌注,白酒折算成酒精后其量及濃度每兩周遞增一次。正常對照組給予等量生理鹽水每日兩次灌胃。各組大鼠于16周全部處死。取肝組織標本,通過HE染色觀察肝臟病理學改變。 3. SOCs通道蛋白分子STIM1及Orai1表達檢測：各組HepG2細胞及ALD大鼠肝組織提取總RNA及總蛋白,熒光定量-PCR和Western blot檢測STIM1及Orail基因和蛋白表達,肝組織行免疫組化檢測STIM1及Orail定位改變。 結(jié)果 1.體外慢性乙醇刺激對HepG2細胞SOCs通道蛋白表達的影響：與正常對照組相比,200mM乙醇刺激明顯增加HepG2細胞STIM1及Orail的基因及蛋白表達量,且其表達增加持續(xù)至少72h。 2.慢性酒精性肝病大鼠造模情況：與對照組相比,模型組大鼠精神萎靡、體重增長緩慢,肝重/體重比增加,肝組織HE染色可觀察到肝細胞脂肪變性、氣球樣變、灶狀壞死及炎癥細胞浸潤。 3.慢性酒精性肝病大鼠肝組織SOCs通道蛋白表達：與正常對照組相比,ALD大鼠肝組織STIM1及Orail的基因及蛋白表達量明顯增高,免疫組化顯示正常對照組見少量STIM1及Orail陽性顆粒分布于中央靜脈及匯管區(qū)周圍,STIM1呈胞漿及胞膜表達,Orail呈胞膜表達,ALD模型組大鼠STIM1及Orail陽性顆粒明顯增多,分布類似,主要分布于酒精性肝損傷中易受損的肝腺泡三區(qū),STIM1呈胞膜聚集趨勢。 結(jié)論 體內(nèi)外研究均顯示慢性乙醇刺激可增加肝細胞SOCs通道蛋白STIM1與Orail的表達,且兩者呈平行性增加,提示乙醇可能通過增高SOCs通道蛋白分子表達,增加胞外鈣離子內(nèi)流而加重肝細胞損傷。 三、鈣池操縱鈣離子通道蛋白RNA干擾對乙醇誘導肝細胞Ca2+濃度增高及肝細胞損傷的影響 目的 觀察針對SOCs通道蛋白分子STIM1及Orail的RNA干擾對乙醇誘導肝細胞Ca2+濃度增高及肝細胞損傷的影響,進一步明確STIM1及Orail在SOCs參與乙醇誘導肝細胞鈣超載及相關(guān)損傷中各自的作用。 方法 1.小干擾RNA(small interference RNA, siRNA)設計合成篩選：根據(jù)在Genebank中檢索的人STIM1、Orail基因序列,利用Sofld軟件設計3對針對人STIM1、Orail基因的siRNA序列。應用陽離子脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染HepG2細胞,Western Blot驗證其對STIM1、Orail表達抑制的有效性,挑選抑制效應最強的siRNA進行下一步實驗。 2. STIM1及Orail的RNA干擾對乙醇誘導肝細胞Ca2+濃度增高及肝細胞損傷的影響：HepG2細胞,分別設立乙醇誘導組、干擾對照組、STIM1干擾組、Orail干擾組及STIM1/Orail共同干擾組,按照第一部分的方法進行肝細胞[Ca2+]cyt檢測、細胞存活率檢測及肝細胞損傷檢測。 結(jié)果 1.STIM1、Orail SiRNA篩選：篩選出針對人STIM1、Orail的siRNA序列各一條,Western Blot驗證可有效抑制STIM1、Orail蛋白表達,抑制效率在60-70%。 2. STIM1及Orail的RNA干擾對乙醇誘導肝細胞Ca2+濃度增高的影響：針對STIM1及STIM1/Orail的RNA干擾可有效降低乙醇引起的HepG2細胞Ca2+濃度增高,且Si-STIM1/Orail組略低于Si-STIM1組,但單獨針對Orail的RNA干擾不能有效降低乙醇引起的HepG2細胞Ca2+濃度增高。 3. STIM1及Orail的RNA干擾對乙醇誘導肝細胞損傷的影響：針對STIM1及STIM1/Orail的RNA干擾可有效增高200mM乙醇刺激后HepG2的細胞存活率,降低200mM乙醇刺激后HepG2培養(yǎng)上清中ALT、AST的含量,但單獨針對Orail的RNA干擾無顯著作用。 結(jié)論 慢性乙醇刺激可能主要通過增高STIM1表達,增加SOCs通道開放的頻率,使胞外鈣離子內(nèi)流增多,從而加重肝細胞損傷,同時乙醇刺激肝細胞Orail表達增多,使SOCs孔通道增多,以輔助STI1作用。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R749.6

【參考文獻】

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2 朱萍;閻明;張莉;王旭平;商楠;劉慧敏;張海濤;;乙醇誘導肝細胞線粒體質(zhì)量和跨膜電位變化的研究[J];中國現(xiàn)代普通外科進展;2007年02期

3 王曉英;閻明;;肝細胞的體外培養(yǎng)及乙醛對肝細胞的形態(tài)影響[J];中國實用醫(yī)藥;2008年04期

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本文編號：2121957