本文選題：MRTF-A　切入點(diǎn)：海馬　出處：《武漢科技大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：目的本研究通過構(gòu)建包裝MRTF-A的慢病毒載體,并微量注射到Tg2576小鼠海馬區(qū),探討MRTF-A對Tg2576小鼠學(xué)習(xí)記憶功能以及對海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡和自噬的影響及機(jī)制。方法第一部分MRTF-A對Tg2576小鼠學(xué)習(xí)記憶功能影響研究1.Tg2576小鼠學(xué)習(xí)記憶功能與內(nèi)源性MRTF-A水平相關(guān)性研究分別選取野生型C57BL小鼠和Tg2576小鼠各10只,適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后以Morris水迷宮和條件恐懼實(shí)驗(yàn)進(jìn)行動(dòng)物行為學(xué)測評,隨后取新鮮海馬組織,分別以Real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測MRTF-A的m RNA和蛋白表達(dá)。2.過表達(dá)MRTF-A對Tg2576小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響構(gòu)建攜帶小鼠MRTF-A(滴度為2×108TU/ml的慢病毒載體),將Tg2576小鼠隨機(jī)分為6組,每組6只,分別于側(cè)腦室注射慢病毒液1μl、2μl、4μl,另設(shè)一組注射同等體積的陰性慢病毒的作為對照組。以側(cè)腦室注射日為0天,在注射后第7天取小鼠新鮮腦組織做石蠟切片,用激光共聚焦顯微鏡觀察不同劑量的慢病毒感染小鼠海馬區(qū)基因的表達(dá)。根據(jù)表達(dá)結(jié)果選取最適劑量行側(cè)腦室注射,分別檢測側(cè)腦室注射慢病毒后第7、14、21、28天后海馬區(qū)的MRTF-A濃度,同時(shí)以條件恐懼實(shí)驗(yàn)和曠場實(shí)驗(yàn)測定其學(xué)習(xí)記憶功能。第二部分MRTF-A對Tg2576小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡及自噬的影響及機(jī)制研究1.過表達(dá)MRTF-A對Tg2576小鼠腦組織神經(jīng)元凋亡和自噬的影響實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組,對照組為野生型C57BL小鼠,模型組和實(shí)驗(yàn)組采用Tg2576小鼠。對照組和模型組側(cè)腦室注射4μl的陰性慢病毒,實(shí)驗(yàn)組注射4μl的MRTF-A慢病毒液。注射后第28天取腦組織石蠟切片做HE染色觀察腦細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,透射電鏡觀察海馬區(qū)自噬小體的生成。2.過表達(dá)MRTF-A對Tg2576小鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元自噬及凋亡相關(guān)基因的影響分組及動(dòng)物處理同第三部分,側(cè)腦室注射慢病毒后第28天取新鮮海馬組織,Real-time PCR和Western blot技術(shù)分別檢測凋亡相關(guān)基因Bcl-2、mcl-1的m RNA和蛋白表達(dá),自噬相關(guān)基因Atg5、Beclin1、Atg7的m RNA表達(dá)、及Beclin1和LC3的蛋白表達(dá)。結(jié)果1.MRTF-A對Tg2576小鼠學(xué)習(xí)記憶功能影響研究:(1)Tg2576小鼠學(xué)習(xí)記憶能力缺陷及海馬MRTF-A表達(dá)水平:與同周齡的野生型C57BL/6J小鼠相比,Tg2576小鼠在Morris水迷宮中到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間延長,條件恐懼測試中Tg2576小鼠恐懼不動(dòng)時(shí)間百分比低于野生型C57BL小鼠(P0.01)。取海馬組織檢測MRTF-A表達(dá),發(fā)現(xiàn)Tg2576小鼠內(nèi)源性MRTF-A水平低于野生型小鼠,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。(2)過表達(dá)MRTF-A可緩解Tg2576小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙:過表達(dá)MRTF-A可緩解Tg2576小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙:側(cè)腦室注射慢病毒1μl熒光表達(dá)較弱,2μl和4μl劑量下可見明顯的熒光表達(dá),4μl劑量組熒光表達(dá)水平明顯高于其它組。故選取4μl作為進(jìn)一步研究海馬注射劑量。4μl MRTF-A慢病毒小鼠腦內(nèi)注射后,與陰性對照組相比,慢病毒注射組MRTF-A表達(dá)水平在注射后第7天達(dá)到最高,到第28天緩慢降低,但仍然高于同期野生型C57BL小鼠腦內(nèi)的表達(dá)水平。慢病毒側(cè)腦室注射一周后,小鼠每隔7天進(jìn)行一次曠場實(shí)驗(yàn)和環(huán)境條件恐懼記憶檢測發(fā)現(xiàn),過表達(dá)MRTF-A之后小鼠曠場實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)總距離沒有明顯變化,第28天時(shí)中央格停留時(shí)間縮短,而第28天后Tg2576小鼠條件恐懼實(shí)驗(yàn)中恐懼不動(dòng)時(shí)間百分比相比于對照組明顯提高。2.過表達(dá)MRTF-A對Tg2576小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡及自噬的影響及機(jī)制研究:(1)將4μl的慢病毒注射入Tg2576小鼠側(cè)腦室后第28天行海馬組織HE染色發(fā)現(xiàn),過表達(dá)MRTF-A能明顯減輕Tg2576小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞缺失及細(xì)胞核固縮情況;透射電鏡觀察海馬區(qū)自噬小體生成情況發(fā)現(xiàn),LV-MRTF-A處理后Tg2576小鼠海馬區(qū)可見發(fā)現(xiàn)有雙層膜環(huán)繞形成的自噬泡。(2)過表達(dá)MRTF-A上調(diào)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、mcl-1的m RNA和蛋白表達(dá),同時(shí)自噬相關(guān)基因Atg5、Atg6、Atg7的m RNA表達(dá)升高,LC3Ⅰ蛋白向LC3Ⅱ蛋白轉(zhuǎn)化增多,Beclin1蛋白表達(dá)上調(diào)。結(jié)論隨著Tg2576小鼠學(xué)習(xí)記憶能力缺陷的發(fā)生,其海馬區(qū)MRTF-A的表達(dá)處于低水平狀態(tài)。腦組織過表達(dá)MRTF-A可改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。其機(jī)制可能通過MRTF-A上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2、mcl-1和自噬相關(guān)基因Atg5、Atg6、Atg7的表達(dá),從而抑制Tg2576小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡,上調(diào)神經(jīng)元自噬水平有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R749.16

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本文編號(hào)：1688068