【摘要】：研究目的:創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)是人類21世紀致死致殘的重要因素,其主要機制與腦創(chuàng)傷后的神經(jīng)元凋亡以及炎癥反應關(guān)系密切。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在細胞凋亡以及免疫炎癥反應中發(fā)揮重要作用,但其與顱腦創(chuàng)傷的關(guān)系尚不明確。本課題組將在既往研究的基礎(chǔ)上探索顱腦創(chuàng)傷小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的變化規(guī)律,并通過牛磺熊去氧膽酸(TUDCA)阻斷顱腦創(chuàng)傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,進一步探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元凋亡、免疫炎癥反應以及血腦屏障破壞中的作用,為顱腦創(chuàng)傷提供新的治療靶點和理論依據(jù)。方法:1.通過采用電控腦挫傷打擊儀(eCCI)制作小鼠腦創(chuàng)傷模型。成年雄性C57/BL6小鼠被隨機分為假手術(shù)組(Sham組)和顱腦創(chuàng)傷組(TBI組)。TBI組小鼠又根據(jù)不同的處死取材時間分為顱腦創(chuàng)傷后12h、1D、3D、7D組。通過Western Blot技術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測TBI小鼠不同時間腦組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)標記物GRP78的變化規(guī)律。2.為了探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在顱腦創(chuàng)傷中的作用,我們通過腹腔注射TUDCA(500mg/kg)阻斷TBI小鼠的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,將實驗動物分為假手術(shù)組(Sham組),顱腦創(chuàng)傷組(TBI組)以及顱腦創(chuàng)傷+TUDCA(TBI+TUDCA組)。應用Western Blot檢測p-PERK,PERK,p-eIF2a,eIF2a,ATF4的表達水平,評估TUDCA對TBI小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的抑制作用;通過改良的神經(jīng)功能學評分(mNSS評分)以及平衡木實驗(Beam Balance實驗)評估內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與TBI小鼠神經(jīng)功能恢復之間的關(guān)系;應用干濕重法評估TBI小鼠的腦組織水腫情況,通過伊文思藍滲漏(Evans Blue滲漏)法評估TBI小鼠血腦屏障的破壞程度,通過Western Blot技術(shù)檢測緊密連接蛋白ZO-1,Claudin5的表達水平,探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與TBI后血腦屏障破壞的的關(guān)系;應用免疫熒光技術(shù)和ELISA試劑盒檢測TBI后小膠質(zhì)細胞的激活情況以及IL-1β、TNFα、IL-6等炎癥因子釋放情況,探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與TBI后免疫炎癥反應的關(guān)系;應用TUNEL試劑盒檢測TBI小鼠神經(jīng)元的凋亡情況以及應用Western Blot技術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測TBI小鼠腦組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)性細胞凋亡蛋白Chop以及Caspase-12在神經(jīng)元中的表達情況,探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與TBI后神經(jīng)元細胞凋亡之間的關(guān)系。3.為了探索TUDCA的神經(jīng)保護作用機制,我們首先通過Western Blot技術(shù)檢測顱腦創(chuàng)傷組小鼠TBI后12h、1D、3D、7D的Akt蛋白的變化規(guī)律。給予小鼠注射TUDCA后檢測不同組別小鼠腦組織Pten、p-Akt、Akt、Bax、Bcl-2的表達水平,探索TUDCA與Akt信號通路及其下游凋亡相關(guān)蛋白的關(guān)系。隨后我們通過給予TBI小鼠口服MK2206(60 mg/kg)以及側(cè)腦室注射siRNA-Akt來阻斷Akt基因的表達,通過應用改良的神經(jīng)功能學評分(mNSS評分)以及平衡木實驗(Beam balance實驗)檢測Akt信號通路被阻斷后TBI小鼠的神經(jīng)功能恢復情況,通過應用Western Blot技術(shù)和qRT-PCR技術(shù)檢測Grp78,p-eIF2a,eIF2a,Bcl-2,Bax,CHOP,p-Akt,Akt,Pten以及Caspase-12的表達水平,進一步探索TUDCA發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制。結(jié)果:1.(1)TBI后,腦組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標記物Grp78的表達水平從12h起開始逐漸升高,并在TBI后3D達到高峰。(2)與Sham組相比,TBI小鼠腦組織神經(jīng)元中CHOP的表達水平也有顯著增加。2.(1)TUDCA可有效阻斷PERK-ATF4-CHOP信號通路的激活,有效抑制TBI后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激水平。(2)阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可顯著改善TBI小鼠的神經(jīng)功能預后。(3)阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可以明顯緩解TBI小鼠的腦組織水腫,減輕血腦屏障滲漏,促進TBI小鼠的血腦屏障修復。(4)阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可明顯降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)性細胞凋亡蛋白在神經(jīng)元中的表達,減少神經(jīng)元凋亡。(5)阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可有效減少TBI后小膠質(zhì)細胞的過度激活以及炎癥因子的釋放,緩解免疫炎癥反應。3.(1)p-Akt的表達水平則從TBI后12h開始逐漸降低,并在TBI后的3D達到最低。(2)TUDCA可以在抑制Pten基因的表達的同時促進Akt信號通路的激活,并通過調(diào)控下游凋亡蛋白的表達緩解TBI引發(fā)的腦組織神經(jīng)細胞凋亡。(3)MK2206(60 mg/kg)以及siRNA-Akt均可以顯著抑制TUDCA對TBI小鼠的神經(jīng)保護作用,進一步驗證TUDCA的保護作用是通過激活Akt信號通路來實現(xiàn)的。結(jié)論:1.TBI可引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)性細胞凋亡蛋白在神經(jīng)元中的表達,且于傷后第3天達到高峰。2.阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可有效促進TBI小鼠的血腦屏障修復,促進血管新生,減少血腦屏障滲漏。3.阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可有效緩解TBI小鼠的炎癥反應,減少神經(jīng)元凋亡,改善TBI小鼠預后。4.TUDCA可有效阻斷Pten基因的表達,并促進Akt信號通路的激活,通過調(diào)控下游Bax、Bcl-2等基因的表達改善TBI小鼠預后。5.Akt抑制劑可明顯阻斷TUDCA的神經(jīng)保護作用,提示TUDCA的神經(jīng)保護作用依賴Akt信號通路的激活來實現(xiàn)。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R651.15

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本文編號：2631109