【摘要】：背景： 顱腦創(chuàng)傷是一種獲得性腦損傷,它可以導(dǎo)致血腦屏障破壞、神經(jīng)元死亡以及神經(jīng)功能障礙。血管新生作為顱腦創(chuàng)傷后修復(fù)的關(guān)鍵因素,它可以為神經(jīng)重塑提供重要的血管基質(zhì),從而有利于傷后長期的功能恢復(fù)。內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是一種單一譜系的干細胞,當受到外傷、炎癥、缺血等刺激后,它可以從骨髓(或其它一些組織、器官)中動員至外周血,歸巢至損傷的部位并分化為血管內(nèi)皮細胞,通過整合入已存在的血管(血管新生)或直接產(chǎn)生新的血管(血管發(fā)生)來發(fā)揮其作用。EPCs的出現(xiàn)打破了血管發(fā)生僅在胚胎階段出現(xiàn)的觀念。前期的動物實驗已證實移植EPCs可促進肢體缺血、心肌缺血、腦梗塞等疾病的功能恢復(fù)。本課題組首次報道了顱腦創(chuàng)傷患者循環(huán)血EPCs數(shù)目與臨床預(yù)后呈正相關(guān),應(yīng)用促紅細胞生成素、他汀、孕酮等刺激動員機體自身的EPCs水平升高從而促進了小鼠顱腦創(chuàng)傷后的功能恢復(fù)。 目的： 本后續(xù)研究旨在通過顱腦創(chuàng)傷后腦室移植臍血內(nèi)皮集落形成細胞(endothelial colony-forming cells, ECFCs,目前被認為是“真正意義”的EPCs群體),證實其減少靜脈移植造成細胞的全身分布,同時可以修復(fù)血腦屏障、促進血管新生,從而利于外傷后功能恢復(fù),為臨床治療提供新的策略。 方法： 從人臍血中分離的單個核細胞經(jīng)過培養(yǎng)和擴增成為ECFCs。成年裸鼠通過液壓打擊建立顱腦創(chuàng)傷模型,于傷后1天側(cè)腦室內(nèi)移植ECFCs,實驗分為ECFCs組、生理鹽水組和假手術(shù)組。采用細胞染料SP-DiIC18(3)和Y染色體熒光原位雜交技術(shù)對移植的細胞進行追蹤。采用腦組織伊文氏藍滲透法和干濕重法來測量血腦屏障的通透性和腦含水量。緊密連接蛋白ZO-1、claudin-5和細胞因子Ang1、Ang2的表達通過免疫印跡和實時熒光定量PCR來檢測。微血管密度應(yīng)用VWF免疫熒光染色的方法來計數(shù)。應(yīng)用改良神經(jīng)功能評分和Morris水迷宮來評價顱腦創(chuàng)傷后的功能結(jié)果。 結(jié)果： 人臍血中分離的單個核細胞培養(yǎng)5-8天可產(chǎn)生ECFCs,大約14天形成集落,ECFCs可攝取乙�；兔芏戎鞍缀徒Y(jié)合荊豆凝集素,同時它表達干細胞標志CD34和內(nèi)皮細胞標志KDR、VWF、VE-cadherin。通過細胞染料SP-DiIC18(3)和Y染色體熒光原位雜交技術(shù)于移植后3天在創(chuàng)傷區(qū)域可檢測到移植的細胞。ECFCs組比生理鹽水組減少了伊文氏藍的滲漏和腦含水量,增加了ZO-1和claudin-5的表達,提高了Angl:Ang2比值,增加了微血管密度。同時,改良神經(jīng)功能評分和Morris水迷宮也說明了ECFCs移植促進了鼠顱腦創(chuàng)傷后運動功能、空間獲取和記憶功能的恢復(fù)。 結(jié)論： 本實驗證實經(jīng)腦室途徑移植的ECFCs可歸巢至腦創(chuàng)傷區(qū)域,其通過修復(fù)破壞的血腦屏障、增強血管新生來促進顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。ECFCs移植未來用于臨床可能會有利于顱腦創(chuàng)傷患者的功能恢復(fù)。
[Abstract]:Background: traumatic brain injury is a kind of acquired brain injury, which can lead to blood-brain barrier damage, neuronal death and neurological dysfunction. Angiogenesis, as a key factor in the repair of traumatic brain injury, can provide an important vascular matrix for neural remodeling, which is beneficial to the long-term functional recovery after traumatic brain injury. Endothelial progenitor cells (endothelial progenitor cells, EPCs) are single lineage stem cells, which can mobilize peripheral blood from bone marrow (or other tissues, organs) when stimulated by trauma, inflammation, ischemia, etc. Homing to the site of the injury and differentiating into vascular endothelial cells, By integrating existing blood vessels (angiogenesis) or directly producing new vessels (angiogenesis) to play its role. The emergence of EPCs breaks the idea that angiogenesis occurs only in the embryonic stage. Previous animal experiments have proved that transplantation of EPCs can promote the functional recovery of limb ischemia, myocardial ischemia, cerebral infarction and other diseases. Our group reported for the first time that the number of circulating EPCs in patients with traumatic brain injury was positively correlated with the clinical prognosis. Progesterone stimulates the increase of EPCs and promotes the recovery of function after traumatic brain injury in mice. Objective: the purpose of this follow-up study was to confirm that endothelial colony-forming cells (ECFCs) in umbilical cord blood after craniocerebral trauma (TBI) can reduce the whole body distribution of cells induced by vein transplantation. At the same time, it can repair the blood-brain barrier, promote angiogenesis, which is conducive to the recovery of post-traumatic function, and provide a new strategy for clinical treatment. Methods: the mononuclear cells isolated from human umbilical cord blood were cultured and amplified into ECFCs. Adult nude mice were used to establish traumatic brain injury model by hydraulic attack. ECFCswere transplanted into lateral ventricle one day after injury. The rats were divided into three groups: ECFCs group, saline group and sham operation group. Cell dye SP-DiIC18 (3) and Y chromosome fluorescence in situ hybridization were used to track the transplanted cells. The permeability of blood-brain barrier and brain water content were measured by Yi Wen's blue osmotic method and dry wet weight method. The expression of tight junction protein ZO-1 claudin-5 and cytokine Ang-1 Ang2 was detected by Western blotting and real-time fluorescent quantitative PCR. Microvessel density was counted by VWF immunofluorescence staining. The modified neurological function score and Morris water maze were used to evaluate the functional results after traumatic brain injury. Results: cultured mononuclear cells isolated from human umbilical cord blood for 5-8 days could produce ECFCsand form colony ECFCs for 14 days to absorb acetylated low density lipoprotein and binding agglutinin. It also expressed stem cell marker CD34 and endothelial cell marker VWFFVE-cadherin. Three days after transplantation, SP-DiIC18 (3) and Y chromosome fluorescence in situ hybridization were used to detect that the Yi Wen blue leakage and brain water content were decreased and the expression of ZO-1 and claudin-5 were increased in the transplanted cells. The ratio of Angl:Ang2 and microvessel density were increased. At the same time, the improved neurological function score and Morris water maze also showed that ECFCs transplantation promoted the recovery of motor function, spatial acquisition and memory function after craniocerebral trauma in rats. Conclusion: this study demonstrated that ECFCs transplanted through the ventricular pathway can be homogenized to the traumatic area of the brain, which can repair the damaged blood-brain barrier. Enhanced angiogenesis to promote the recovery of neural function after traumatic brain injury .ECFCs transplantation in the future may be beneficial to the functional recovery of patients with traumatic brain injury.
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R651.15

【共引文獻】

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本文編號：2122319