本文選題：膿毒癥 + 精氨酸　； 參考：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：第一部分瓜氨酸對(duì)膿毒癥大鼠肝損傷及Cit-NO循環(huán)的影響背景與目的:臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn),膿毒癥時(shí)血漿及肌肉中的精氨酸(Arg)水平明顯下降,然而對(duì)膿毒癥患者直接補(bǔ)充外源性精氨酸并不能改善膿毒癥的病情發(fā)展。瓜氨酸(Cit)可以通過“瓜氨酸—一氧化氮循環(huán)”(Cit-NO cycle)參與精氨酸的體內(nèi)代謝。并且肝臟是參與Cit-NO循環(huán)的重要器官之一,同時(shí)也是膿毒癥發(fā)生發(fā)展中最容易受到損傷的器官之一。因此,本研究探討補(bǔ)充外源性瓜氨酸對(duì)膿毒癥大鼠肝損傷以及Cit-NO循環(huán)的影響。方法:本研究采用最經(jīng)典的盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)膿毒癥大鼠模型,將大鼠分為正常組(Normal group),假手術(shù)組(sham group),瓜氨酸組(Cit group),生理鹽水組(NS group),CLP模型組(CLP group)以及CLP模型加瓜氨酸組(CLP+Cit group)。再根據(jù)CLP造模后大鼠被處死的時(shí)間點(diǎn),CLP組和CLP+Cit組又各自分出6h,12h,24h,48h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)亞組。Cit組和CLP+Cit組大鼠術(shù)前給予瓜氨酸連續(xù)灌胃給藥7天,劑量為200mg/d。術(shù)后每6小時(shí)觀察各組大鼠一般狀況及生存情況,在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)處死各組大鼠,收集大鼠血液及肝臟組織樣本。取大鼠血液使用生化檢測儀檢測大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平。取肝臟組織做HE染色觀察病理變化情況,利用檢測試劑盒分別測量大鼠肝臟組織超氧化物歧化酶(SOD)的活力、丙二醛(MDA)的含量、NO的含量以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(i NOS)的活力。運(yùn)用高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)檢測大鼠血漿中Cit和Arg含量。所有相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析利用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行,設(shè)定P0.05為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果:Sham group,Cit group和NS group存活率均為100%(8/8)。CLP group術(shù)后6h,12h,24h,48h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)亞組相對(duì)應(yīng)的存活率分別為:75%(9/12),50%(8/16),33.33%(8/24)和6.25%(2/32)。CLP+Cit group術(shù)后6h,12h,24h,48h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)亞組相對(duì)應(yīng)的存活率分別為:83.33%(10/12),68.75%(11/16),66.67%(16/24)和25%(8/32)。CLP+Cit 24h和48h亞組大鼠的生存率均顯著高于相對(duì)應(yīng)的CLP 24h和48h亞組大鼠(both P0.05)。HE染色結(jié)果顯示所有CLP組和CLP+Cit組大鼠肝臟均出現(xiàn)不同程度的肝損傷相關(guān)病理改變。此外,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CLP+Cit 12h和24h亞組大鼠血清AST水平顯著低于CLP 12h和24h亞組(both P0.05)。在CLP術(shù)后6h,12h,24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn),CLP+Cit各組大鼠肝臟SOD活力值都顯著高于CLP各組(all P0.05)。然而,CLP+Cit各組大鼠肝臟MDA水平都低于CLP各組,其中CLP+Cit 12h和24h亞組大鼠肝臟MDA水平顯著低于CLP 12h和24h亞組(both P0.01)。另外,在CLP術(shù)后6h,12h,24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn),CLP各組大鼠肝臟NO水平都顯著高于CLP+Cit各組(all P0.05)。同時(shí),i NOS活力在CLP+Cit各組中都低于CLP各組,但比較不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(all P0.05)。在術(shù)后24h內(nèi),CLP組大鼠血漿Arg水平隨著時(shí)間變化呈下降趨勢,并且CLP 24h亞組大鼠血漿Arg含量顯著低于正常組(P0.01)。此外,CLP+Cit組大鼠血漿Arg濃度明顯高于CLP組(P0.05)。CLP術(shù)后24h內(nèi),CLP+Cit組大鼠血漿Arg水平改變不顯著,CLP+Cit 24h亞組大鼠血漿Arg含量接近基線水平(Cit group)。結(jié)論:補(bǔ)充外源性瓜氨酸可以改善膿毒癥大鼠的生存情況,提高存活率。補(bǔ)充外源性瓜氨酸可以使得膿毒癥大鼠肝組織SOD活力升高,提高膿毒癥大鼠肝臟抗氧化的能力,對(duì)肝臟具有保護(hù)作用。補(bǔ)充外源性瓜氨酸可以降低膿毒癥早期大鼠肝臟中MDA水平,減輕肝臟受損傷程度。外源性瓜氨酸可以減少膿毒癥時(shí)NO的生成,提高血漿Arg含量并且使之維持在基線水平。第二部分瓜氨酸對(duì)膿毒癥早期細(xì)胞因子表達(dá)的影響背景與目的:細(xì)胞因子在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中扮演著十分重要的角色。膿毒癥早期,機(jī)體處于促炎階段,此時(shí)體內(nèi)產(chǎn)生大量的促炎細(xì)胞因子,主要包括IL-1、IL-6、TNF-α等。這些促炎細(xì)胞因子的釋放,激活機(jī)體先天性或者適應(yīng)性免疫應(yīng)答,進(jìn)一步誘導(dǎo)其它細(xì)胞因子或炎癥介質(zhì)釋放,引起“細(xì)胞因子風(fēng)暴”,是造成肝損傷的重要因素。前期研究發(fā)現(xiàn)外源性瓜氨酸可以降低膿毒癥大鼠促炎因子IL-6的表達(dá),被視為一種安全的免疫調(diào)節(jié)途徑。因此,本部分研究在前期研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步全面探討外源性瓜氨酸對(duì)膿毒癥早期主要細(xì)胞因子表達(dá)的影響。方法:利用CLP膿毒癥大鼠模型,將大鼠分為正常組(Normal group),瓜氨酸組(Cit group),CLP模型組(CLP group)以及CLP模型加瓜氨酸組(CLP+Cit group)。根據(jù)造模后大鼠被處死的時(shí)間點(diǎn),CLP組和CLP+Cit組又各自分出6h,12h,24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)亞組。利用Luminex懸浮液態(tài)芯片技術(shù)對(duì)各組大鼠血清中細(xì)胞因子的濃度進(jìn)行檢測,總共包括27種細(xì)胞因子和趨化因子:EGF,Eotaxin,Fractalkine,G-CSF,GM-CSF,GRO/KC/CINC-1,IFN-γ,IL-1α,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,IL-12(p70),IL-13,IL-17A,IL-18,IP-10,Leptin,LIX,MCP-1,MIP-1α,MIP-2,RANTES,TNF-α和VEGF。結(jié)果:懸浮液態(tài)芯片檢測細(xì)胞因子得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及質(zhì)控參數(shù)結(jié)果均滿意。細(xì)胞因子濃度結(jié)果顯示,CLP 6h亞組大鼠血清中所有檢測的27種細(xì)胞因子濃度都高于正常組,其中21種細(xì)胞因子的濃度比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。其余6種細(xì)胞因子IL-13,Fractalkine,LIX,IL-18,VEGF,IL-12(p70)在CLP 6h亞組中的濃度同樣高于正常組,但不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在CLP造模后24h內(nèi),總共檢測的27種細(xì)胞因子中,20種細(xì)胞因子的血清濃度水平達(dá)到峰值的時(shí)間點(diǎn)在CLP+Cit group中晚于CLP group,包括EGF,Eotaxin,G-CSF,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,IL-12(p70),IFN-γ,IL-17,Leptin,MCP-1,MIP-1α,MIP-2,TNF-α,VEGF,IL-13和Fractalkine。只有2種細(xì)胞因子GM-CSF和IP-10的濃度峰值在CLP+Cit group中出現(xiàn)得早于CLP group。此外在CLP術(shù)后6h時(shí),促炎細(xì)胞因子TNF-α,IL-1β,IL-6在CLP6h亞組大鼠血清中的濃度明顯高于CLP+Cit 6h亞組(all P0.05)。而在造模后24h時(shí)間點(diǎn)上,主要的抗炎因子IL-4和IL-10在CLP+Cit 24h亞組大鼠血清中的濃度比CLP 24h亞組高出5倍左右,其中血清IL-4的比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)結(jié)論:芯片結(jié)果表明我們實(shí)驗(yàn)中CLP膿毒癥大鼠模型建立效果滿意。補(bǔ)充外源性瓜氨酸可以延緩膿毒癥早期體內(nèi)細(xì)胞因子和趨化因子的釋放。補(bǔ)充外源性瓜氨酸使得膿毒癥早期機(jī)體的“促炎狀態(tài)”得到緩解,減少促炎細(xì)胞因子TNF-α,IL-1β,IL-6的大量釋放。外源性瓜氨酸使得抗炎細(xì)胞因子IL-4和IL-10的釋放延遲。第三部分瓜氨酸對(duì)膿毒癥大鼠STAT1/STAT3信號(hào)通路的影響背景與目的:JAK/STAT信號(hào)通路是多種炎癥細(xì)胞因子的共同信號(hào)通路,在膿毒癥中發(fā)揮著舉足輕重的作用。其中STAT1和STAT3在膿毒癥中相關(guān)作用的研究報(bào)道尤為突出,被認(rèn)為是與膿毒癥關(guān)系最為密切的STAT家族成員,參與許多炎癥因子的信號(hào)傳導(dǎo)過程。本部分研究在前一部分研究的基礎(chǔ)上,探討補(bǔ)充外源性瓜氨酸對(duì)膿毒癥大鼠STAT1/STAT3信號(hào)通路的影響。方法:利用CLP膿毒癥大鼠模型,將大鼠分為CLP模型組(CLP group)以及CLP模型加瓜氨酸組(CLP+Cit group)。根據(jù)造模后大鼠被處死的時(shí)間點(diǎn),CLP group和CLP+Cit group又各自分出6h,12h,24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)亞組。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測CLP group和CLP+Cit group大鼠造模術(shù)后6h,12h,24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)肝臟組織中STAT1和STAT3的m RNA表達(dá)水平。利用免疫印跡方法檢測CLP group和CLP+Cit group大鼠肝臟組織中STAT1和STAT3的蛋白表達(dá)水平以及磷酸化水平。結(jié)果:在術(shù)后6h,12h,24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn),STAT1和STAT3 m RNA相對(duì)表達(dá)量在CLP group和CLP+Cit group之間都不存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。同樣在這三個(gè)時(shí)間點(diǎn)上,CLP group和CLP+Cit group大鼠肝臟組織中STAT1和STAT3蛋白表達(dá)水平也不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。但是,CLP+Cit 6h和12h亞組大鼠肝臟組織STAT1和STAT3的磷酸化水平則明顯低于CLP 6h和12h亞組(P0.05)。結(jié)論:在CLP誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠中,補(bǔ)充外源性瓜氨酸不影響STAT1和STAT3的m RNA水平及蛋白表達(dá)水平,但是可以下調(diào)膿毒癥早期STAT1和STAT3蛋白的磷酸化水平。
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【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R459.7
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本文編號(hào)：1755611