本文關(guān)鍵詞：Notch-1信號通路在缺氧下對星形膠質(zhì)細胞增殖和活化的影響及作用機制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究目的新生兒缺氧性腦病是指新生兒在圍產(chǎn)期缺氧而引起的腦組織的缺氧性損害,主要由宮內(nèi)窘迫、新生兒缺氧窒息引起,該疾病多發(fā)生在足月兒,有時可發(fā)生在早產(chǎn)兒,也可以發(fā)生在由其他因素引發(fā)的腦組織損害。目前已知,新生兒缺氧性腦損害與星形膠質(zhì)細胞的增殖和活化有關(guān)。我們目前的研究發(fā)現(xiàn),在缺氧刺激下,星形膠質(zhì)細胞大量增殖,細胞中NICD和Hes-1蛋白表達增多,推測這可能與該細胞中Notch-1因子的激活和表達上調(diào)有關(guān)。然而,Notch-1在缺氧條件下對星形膠質(zhì)細胞的調(diào)節(jié)機制還不是很清楚。因此,本研究利用wistar新生大鼠構(gòu)建缺氧模型,通過觀察缺氧星形膠質(zhì)細胞中重要分子表達的變化,探尋Notch信號通路在其中可能發(fā)揮的作用,并進一步探討Notch-1信號對星形膠質(zhì)細胞增殖和活化的影響及其可能的作用機制,以期為人類新生兒缺氧性腦損害的臨床防護與治療提供新途徑。研究方法1.應用RT-PCR和蛋白印跡技術(shù)分別檢測缺氧星形膠質(zhì)細胞(實驗組)和正常氧含量星形膠質(zhì)細胞(對照組)中Notch-1 mRNA、 Notch-1蛋白、NICD蛋白、Hes-1mRNA、Hes-1蛋白的表達量,抑制Notch信號通路后,觀察Hes-1 mRNA、Hes-1蛋白表達量的變化。2.應用BrdU技術(shù)檢測星形膠質(zhì)細胞的細胞增殖,探索Notch信號通路在其中發(fā)揮的作用。3.應用RT-PCR技術(shù)觀測星形膠質(zhì)細胞中TNF-α和IL-1 β等炎性因子的變化,探討Notch信號通路對這些因子表達的影響。4.應用RT-PCR技術(shù)檢測星形膠質(zhì)細胞中GFAP mRNA、VEGF mRNA的表達,利用蛋白印跡法、ELISA、免疫熒光等技術(shù)檢測GFAP、 VEGF蛋白的表達情況,探討抑制Notch信號通路對缺氧的星形膠質(zhì)細胞中GFAP和VEGF表達的影響。5.應用蛋白印跡法、ELISA、siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)觀察VEGF和NF-κB的表達情況,探討缺氧下NF-κ B和VEGF通路對星形膠質(zhì)細胞增殖和活化的影響。研究結(jié)果1.在缺氧刺激下,星形膠質(zhì)細胞中的Notch信號通路的變化。為了確定在低氧刺激下Notch-1信號是否被活化,我們通過RT-PCR、免疫熒光等技術(shù)檢測Notch-1基因在星形膠質(zhì)細胞中的表達量,利用蛋白質(zhì)印記法檢測Notch-1這種蛋白質(zhì)的表達情況。結(jié)果顯示,低氧刺激下,Notch-1的mRNA表達明顯增高。免疫熒光結(jié)果顯示,與空白對照組相比,低氧環(huán)境下星形膠質(zhì)細胞中的Notch-1明顯增加。蛋白質(zhì)印記法顯示,低氧環(huán)境下Notch-1蛋白的表達也增多了。由于Notch-1表達的升高,我們進一步探索低氧處理過的星形膠質(zhì)細胞中Notch信號通路的活化情況。結(jié)果顯示,12hH寸,與對照組相比,低氧星形膠質(zhì)細胞中NICD蛋白表達增多。通過免疫熒光的結(jié)果可以看出,低氧下NICD在星形膠質(zhì)細胞的細胞質(zhì)和細胞核中(尤其是細胞核中)的熒光強度比對照組強。低氧下6h、12h時,星形膠質(zhì)細胞中Hes-1 mRNA、Hes-1蛋白的表達升高,用DAPT處理后,其表達受抑制。2. DAPT對Notch信號通路的影響本研究通過BrdU來檢測星形膠質(zhì)細胞的細胞增殖,進而探索Notch信號通路在其中發(fā)揮的作用。缺氧刺激12h后,BrdU陽性的細胞與總的細胞數(shù)的比值從31.7±3.8%增長到了48.4±4.5%；而用DAPT處理過的細胞,BrdU陽性細胞的比率下降到了31±5%3. Notch信號通路對星形膠質(zhì)細胞分泌的TNF-α和IL-1 β這些炎性因子的影響缺氧導致了星形膠質(zhì)細胞中TNF-α和IL-1 β的mRNA表達量的明顯提高,在用DAPT處理過的星形膠質(zhì)細胞中,TNF-α的mRNA的表達變化不大, IL-1 β的mRNA的表達受到了明顯的抑制。ELISA實驗結(jié)果顯示,DAPT處理過的星形膠質(zhì)細胞中IL-1 β蛋白的表達量明顯減少,TNF-α蛋白的表達量沒有明顯變化。4. DAPT對缺氧的星形膠質(zhì)細胞中GFAP和VEGF表達的影響抑制星形膠質(zhì)細胞中的Notch信號通路導致GFAP的mRNA表達明顯降低。RT-PCR的結(jié)果顯示,在用DAPT處理過的星形膠質(zhì)細胞中,VEGF的mRNA的表達受到了明顯的抑制。ELISA的結(jié)果顯示,DAPT處理過的星形膠質(zhì)細胞中,VEGF的分泌減少。在缺氧的星形膠質(zhì)細胞中,VEGF的表達量明顯高于對照組,但這種現(xiàn)象在經(jīng)過DAPT處理后消失。蛋白質(zhì)印記法結(jié)果顯示,低氧條件下的腦組織VEGF的表達明顯高于空白對照組,然而用DAPT處理后,低氧下,VEGF蛋白的表達量下降。5.低氧下NF-κB和VEGF通路對星形膠質(zhì)細胞增殖和活化的影響蛋白印跡法和ELISA實驗結(jié)果顯示,低氧下星形膠質(zhì)細胞中NF-κB/p65表達明顯升高,經(jīng)DAPT處理后其表達下降。siRNA敲除VEGF和NF-κB后,抑制了星形膠質(zhì)細胞的增值和活化。研究結(jié)論1.在低氧環(huán)境下,原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞中Notch被活化。2. Notch可以被DAPT阻滯,從而抑制了星形膠質(zhì)細胞的增殖。3.在星形膠質(zhì)細胞中被阻滯了的Notch信號通路抑制了炎性因子IL-1 β的產(chǎn)生,對炎性因子TNF-α的影響不大。4.經(jīng)過DAPT處理過的缺氧的星形膠質(zhì)細胞抑制了GFAP和VEGF的表達。5.抑制NF-κB和VEGF通路能抑制缺氧的星形膠質(zhì)細胞的增殖和活化。
【關(guān)鍵詞】：Notch 星形膠質(zhì)細胞 低氧 增殖 活化
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R364.4
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號說明13-16
• 前言16-19
• 材料與方法19-34
• 結(jié)果34-37
• 討論37-38
• 結(jié)論38-39
• 附圖39-44
• 附表44-45
• 參考文獻45-49
• 致謝49-50
• 攻讀學位期間發(fā)表的學位論文50-51
• 附件51

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本文編號：427044