目的建立高效的EV71病毒反向遺傳學(xué)系統(tǒng),通過轉(zhuǎn)染和侵染兩種不同的方式快速獲得拯救病毒并鑒定其活性,同時對兩種獲得病毒的方式進(jìn)行對比并探討其特點與優(yōu)勢。方法1.先構(gòu)建含有人RNA聚合酶I啟動子(Ppol I)、ccdB自殺基因和鼠終止子(mTer)的接收質(zhì)粒pHT-ccdB,并在ccdB兩側(cè)引入AarI酶切位點;為了回避EV71病毒基因組中自身的AarI酶切位點,分兩段PCR擴(kuò)增基因組,在引物中引入必需的AarI酶切位點,通過Golden Gate clone法連接到目的載體中獲得病毒拯救質(zhì)粒pHT-EV71,轉(zhuǎn)染至RD細(xì)胞后,獲得拯救的EV71病毒,并以RT-PCR、病毒滴度、Western blot、以及電鏡檢測等方法鑒定拯救子代病毒。2.將已構(gòu)建病毒拯救質(zhì)粒pHT-EV71轉(zhuǎn)化到DAP營養(yǎng)缺陷型的大腸桿菌Sw106感受態(tài)中,隨機(jī)挑出12個較大的菌落進(jìn)行培養(yǎng),將獲得的菌液直接侵染到RD細(xì)胞中,收集出現(xiàn)CPE現(xiàn)象的RD細(xì)胞上清,獲得拯救病毒,并以RT-PCR、病毒滴度、Western blot、以及電鏡檢測等方法鑒定拯救子代病毒。3.將轉(zhuǎn)染和侵染兩種方式獲得的拯救病毒和野生毒株通過病...

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
符號說明
摘要
英文摘要
前言
第一部分 EV71反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的構(gòu)建與質(zhì)粒鑒定
    1.材料和方法
    2.實驗結(jié)果
    3.討論
第二部分 拯救病毒的獲得及鑒定
    1.材料和方法
    2.實驗結(jié)果
    3.討論
第三部分 兩種拯救病毒的獲得方法的總結(jié)及初步探討
    1.材料與方法
    2.實驗結(jié)果
    3.討論
全文小結(jié)
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述 腸道病毒EV71的研究進(jìn)展
    參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)位論文



本文編號：3795552