目的建立同時檢測藍氏賈第鞭毛蟲和微小隱孢子蟲的雙重?zé)晒舛縋CR兩步檢測方法。方法針對藍氏賈第鞭毛蟲的gdh基因和微小隱孢子蟲的cowp基因分別設(shè)計特異性引物和TaqMan探針。優(yōu)化引物和探針濃度后,確定反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,對其靈敏度、特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性進行評價。通過與金標(biāo)層析法進行醫(yī)源性腹瀉樣本檢測的比較評估該方法的實際應(yīng)用價值。結(jié)果該方法能特異地檢測藍氏賈第鞭毛蟲和微小隱孢子蟲,對其它非目標(biāo)蟲種均不產(chǎn)生擴增曲線,特異性良好。對陽性質(zhì)粒pMD^TM19-T-GIA和pMD^TM19-T-CRY同時定量擴增的敏感度分別為45.1 copies/μL和52.8 copies/μL;陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線在10⁹ copies/μL～10¹ copies/μL之間線性關(guān)系良好（R²=0.99）,批內(nèi)和批間重復(fù)實驗的變異系數(shù)均小于5%。該方法與金標(biāo)層析法具有較好的一致性。結(jié)論建立的雙重?zé)晒舛縋CR兩步法可快速、靈敏、特異地同時檢測藍氏賈第鞭毛蟲和微小隱孢子蟲,具有較好的實際應(yīng)用價... 

【文章來源】：中國人獸共患病學(xué)報. 2020,36(01)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

藍氏賈第鞭毛蟲特異性引物(GIA-F/R)和探針(GIA-P)的濃度優(yōu)化結(jié)果

微小隱孢子蟲特異性引物(CRY-F/R)和探針(CRY-P)的濃度優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)2.2引物和探針濃度優(yōu)化的結(jié)果,最終確定雙重FQ-PCR體系,體系組分包括:Premix Ex TaqTM(Probe qPCR) 10 μL、GIA-F(10 μmol/L) 0.8 μL、GIA-R(10 μmol/L) 0.8 μL、CRY-F(10 μmol/L) 0.8 μL、CRY-R(10 μmol/L) 0.8 μL、GIA-P(10 μmol/L) 0.6 μL、CRY-P(10 μmol/L) 0.6 μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL、兩蟲DNA模板各2 μL,DEPC H2O補足體積至20 μL。用雙重FQ-PCR體系檢測藍氏賈第鞭毛蟲和微小隱孢子蟲樣本的結(jié)果見圖3,結(jié)果表明該體系能同時檢測兩蟲或任意一種蟲種。2.4 雙重FQ-PCR體系的靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)曲線

【參考文獻】：
期刊論文
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[4]兩種檢測方法應(yīng)用于城市水源中藍氏賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲污染的比較研究[J]. 張小萍,朱倩,蔣守富,江莉,何艷燕,張耀光,王真瑜.  國際醫(yī)學(xué)寄生蟲病雜志. 2015 (06)
[5]C2株藍氏賈第鞭毛蟲SUMO特異性蛋白酶基因的克隆、生物信息學(xué)分析及其催化活性區(qū)的原核表達[J]. 李少東,周英斌,劉曉莉,禇晗,李思瑾,田喜鳳,王洋.  中國人獸共患病學(xué)報. 2015(03)
[6]實時熒光PCR檢測藍氏賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲方法的建立[J]. 楊曉華,侯炎昌.  熱帶醫(yī)學(xué)雜志. 2013(06)
[7]上海市飲用水和環(huán)境水中隱孢子蟲和藍氏賈第鞭毛蟲污染狀況調(diào)查[J]. 張小萍,何艷燕,朱倩,馬曉疆,蔡黎.  中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志. 2010(06)

碩士論文
[1]實驗用牛、羊賈第蟲與隱孢子蟲多重PCR方法的建立與應(yīng)用[D]. 高宇航.吉林大學(xué) 2018



本文編號：3316201