在受到病原微生物侵襲的情況下,機(jī)體天然免疫系統(tǒng)能迅速感知入侵的病原體,發(fā)揮免疫防御功能,維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。天然免疫細(xì)胞可表達(dá)多種類型的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs)并在抵御病原體過(guò)程中發(fā)揮了重要作用,其能通過(guò)識(shí)別特定的病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)或損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs),活化天然免疫反應(yīng)信號(hào)通路,產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素從而發(fā)揮抗感染功能。這其中涉及的天然免疫信號(hào)通路主要包括:Toll樣受體(Toll like receptors,TLRs)識(shí)別相應(yīng)配體后引起的下游NF-κB、MAPK和IRF3通路活化;RIG-I樣受體(RIG-I-like receptors,RLRs)識(shí)別RNA后引起的下游IRF3通路活化以及NOD樣受體(NOD-like receptors,NLRs)所誘導(dǎo)的NF-κB和MAPK通路活化。天然免疫活化后會(huì)誘導(dǎo)一系列炎性細(xì)胞因子的表達(dá),誘發(fā)炎癥反應(yīng),這是機(jī)體抵御感染、清除入侵的病原體所必需的。然而炎性細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素的大量產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致過(guò)度的炎癥反應(yīng),損傷正常的組織器官。因此,天然免疫的活化需要通過(guò)多種方式進(jìn)行嚴(yán)格的調(diào)控,以確保其適度活化,既能清除病原體,又不會(huì)損傷自身。目前比較受到關(guān)注的天然免疫調(diào)控主要涉及兩大方面:其一是天然免疫信號(hào)通路相關(guān)蛋白的翻譯后修飾(posttranslational modifications,PTMs),包括磷酸化、泛素化等。這些蛋白的翻譯后修飾通常發(fā)生在胞漿當(dāng)中,已經(jīng)得到相對(duì)充分的研究。其二是炎性細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素產(chǎn)生所受到的直接或間接的表觀調(diào)控。最新的研究顯示天然免疫的活化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核的重編程以及表觀因子的表達(dá)變化,這說(shuō)明天然免疫的適度活化離不開(kāi)表觀因素的調(diào)控,因此近年來(lái)天然免疫表觀調(diào)控領(lǐng)域的研究受到較多的關(guān)注。但由于表觀修飾的復(fù)雜性、多樣性,許多表觀調(diào)控分子在天然免疫調(diào)控中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制仍不清楚。不同類型的表觀修飾在基因表達(dá)調(diào)控中具有不同的功能。DNA甲基化修飾和基因表達(dá)沉默、轉(zhuǎn)錄抑制密切相關(guān),組蛋白乙酰化則促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。與這兩者不同的是組蛋白甲基化修飾對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控并非是單一的,修飾位點(diǎn)不同、甲基化程度不同,其對(duì)基因表達(dá)的影響也就不同。已有的研究顯示組蛋白3第4位賴氨酸的3甲基化(trimethylation of histone 3 lysine 4,H3K4me3)、H3K36me3及H4K20me1通常作為轉(zhuǎn)錄活化的標(biāo)志,而H3K9me3、H4K20me3和H3K27me3則會(huì)介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制。組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(histone lysine-specific methyltransferases,KMTs)和組蛋白賴氨酸去甲基化酶(histone lysine-specific demethylases,KDMs)可以動(dòng)態(tài)調(diào)控組蛋白的甲基化狀態(tài),從而控制基因表達(dá)。表觀修飾在生物體的胚胎發(fā)育、機(jī)體衰老和腫瘤發(fā)生等多方面發(fā)揮了重要的功能。近些年來(lái),表觀修飾與炎癥反應(yīng)和天然免疫活化的關(guān)系也得以研究,已有多個(gè)位點(diǎn)的組蛋白甲基化修飾被證明和天然免疫反應(yīng)相關(guān)。組蛋白H3K79位點(diǎn)的甲基化修飾在基因的表達(dá)調(diào)控中也起著重要作用,該位點(diǎn)的甲基化修飾通常和轉(zhuǎn)錄活化相關(guān)。目前關(guān)于H3K79位點(diǎn)甲基化修飾功能的研究多集中于細(xì)胞分化、DNA損傷修復(fù)、端粒沉默等方面,其在天然免疫調(diào)控中的作用及其對(duì)炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響尚不清楚。迄今為止,H3K79位點(diǎn)唯一明確的組蛋白甲基化修飾酶是Dot1l,其能催化H3K79位點(diǎn)單/雙/三甲基化修飾。已證明Dot1l參與了白血病、乳腺癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。作為一個(gè)可以調(diào)控基因表達(dá)的組蛋白修飾酶,其在調(diào)控天然免疫活化中或許也發(fā)揮著重要的功能,本課題對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行了深入研究。我們對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分別進(jìn)行TLR配體LPS、Poly(I:C)刺激或水泡口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus,VSV)感染后,用ChIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Il6、Ifnb1和Tnfa啟動(dòng)子區(qū)H3K79me2/3修飾的變化,結(jié)果顯示在不同的處理后Il6和Ifnb1啟動(dòng)子區(qū)H3K79me2/3修飾均上升,但Tnfa啟動(dòng)子區(qū)只出現(xiàn)H3K79me2修飾增加,H3K79me3并未有明顯變化。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在TLR3配體Poly(I:C)、TLR4配體LPS以及VSV處理后,Dot1l蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)。對(duì)人單核細(xì)胞THP1進(jìn)行LPS刺激或VSV感染也得到了相同結(jié)果。我們進(jìn)一步用靶向Dot1l的siRNA和慢病毒分別干擾小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和人THP1中的Dot1l表達(dá),發(fā)現(xiàn)干擾Dot1l后可抑制TLR受體活化誘導(dǎo)的IL-6、IFN-β的產(chǎn)生以及RIG-I受體活化誘導(dǎo)的INF-β的產(chǎn)生,但對(duì)TNF-α的表達(dá)沒(méi)有顯著影響。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)干擾Dot1l的表達(dá)對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中NF-κB、MAPK和IRF3信號(hào)通路的活化并沒(méi)有顯著影響。進(jìn)一步檢測(cè)了天然免疫活化后Dot1l在Il6、Ifnb1、Tnfa啟動(dòng)子區(qū)的募集情況,發(fā)現(xiàn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞LPS或Poly(I:C)刺激后能促使Il6啟動(dòng)子區(qū)的Dot1l募集增加,但Tnfa啟動(dòng)子區(qū)并未出現(xiàn)Dot1l的結(jié)合。LPS、Poly(I:C)刺激或VSV感染也能促使Ifnb1啟動(dòng)子區(qū)Dot1l的募集。干擾小鼠腹腔巨噬細(xì)胞或人THP1中的Dot1l表達(dá)則能抑制天然免疫活化后Il6、Ifnb1啟動(dòng)子區(qū)H3K79me2/3的修飾。綜上所述,Il6和Ifnb1的轉(zhuǎn)錄活化和其啟動(dòng)子區(qū)的H3K79me2/3修飾密切相關(guān)。天然免疫活化后,Dot1l能夠選擇性地結(jié)合到Il6和Ifnb1啟動(dòng)子區(qū),催化H3K79me2/3修飾,增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性,從而促進(jìn)IL-6和IFN-β的表達(dá)。我們的研究揭示了H3K79位點(diǎn)甲基化修飾與天然免疫反應(yīng)的關(guān)系以及Dot1l在調(diào)控天然免疫反應(yīng)中的功能,可為炎癥性和感染性疾病的研究與治療提供潛在的靶標(biāo)。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

然免疫活化后 Il6 和 Ifnb1 啟動(dòng)子區(qū)的 H3K79me2/3 修飾增加 1. H3K79me2/3 modification at Il6 and Ifnb1 promoter is instimuliIP analysis of H3K79me2 modification at Il6 promoter in mouhages stimulated with LPS or Poly(I:C) for 0, 0.5, 1 hr. IgG as the neIP analysis of H3K79me2 modification at Tnfa promoter in mohages stimulated with LPS or Poly(I:C) for 0, 0.5, 1 hr. IgG as the neIP analysis of H3K79me2 modification at Ifnb1 promoter in mohages stimulated with LPS, Poly(I:C) for 0, 0.5, 1 hr or infected withgG as the negative control. (D) ChIP analysis of H3K79me3 modi

2．TLR 配體刺激或 RNA 病毒感染誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞 Dot1l 表達(dá)升高H3K79 位點(diǎn)的甲基化修飾主要由 Dot1l 催化。已有文獻(xiàn)顯示 Dot1l 在一些慢癥性疾病患者體內(nèi)的天然免疫細(xì)胞中表達(dá)升高[41,42]。為明確Dot1l與天然免疫的我們用 Poly(I:C)和 LPS 分別刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，并取 0、1、2、4 小時(shí)這幾間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞總蛋白提取。此外，我們也用 VSV 對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞進(jìn)行了感并提取感染 0，6，8，12 小時(shí)后的細(xì)胞總蛋白。對(duì)不同刺激處理的小鼠腹腔巨噬總蛋白進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，分析小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中 Dot1l 的表達(dá)變化。結(jié)果LPS、Poly(I:C)刺激或 VSV 感染后 Dot1l 在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中表達(dá)呈現(xiàn)先上升降的趨勢(shì) (圖 2A)。隨后我們?cè)谟?PMA 誘導(dǎo) THP1 分化并重復(fù)了以上實(shí)驗(yàn)，以在人源性的單核巨噬細(xì)胞中 Dot1l 表達(dá)是否有相似的反應(yīng)。由于 Poly(I:C)無(wú)法很活化 THP1 細(xì)胞，我們只檢測(cè)了 LPS 刺激和 VSV 感染后 THP1 中的 Dot1l 表達(dá)結(jié)果和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞一致，Dot1l 在 LPS 刺激或者 VSV 感染的 THP1 細(xì)胞現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)(圖 2B)。

沉默Dot1l能夠抑制TLR或RIG-I活化誘導(dǎo)的IL-6、IFN-β產(chǎn)生Figure3.SilencingofDot1linhibitstheproductionofIL-6andIFN-βuponinnate
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本文編號(hào)：2847248