目的:構(gòu)建帶有增強(qiáng)型熒光蛋白(EGFP)標(biāo)記的針對(duì)大鼠Slfn1(Schlafen1,睡眠因子1)的shRNA(發(fā)夾狀RNA)干擾載體,并進(jìn)行腺病毒包裝,將其轉(zhuǎn)染至原代培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)48h后,觀察Slfn1的沉默表達(dá)對(duì)VSMCs增殖的影響。方法:1、根據(jù)Rat Slfn1基因的轉(zhuǎn)錄本設(shè)計(jì)并合成3個(gè)干擾RNA靶點(diǎn)shRNA-Slfn1(1)、shRNA-Slfn1(2)、shRNA-Slfn1(3)和1個(gè)陰性對(duì)照序列NC-shRNA,并將單鏈的引物退火成雙鏈oligo序列,連接入雙酶切線性化的RNA干擾載體(pDKD-CMV-U6-shRNA)的U6啟動(dòng)子下游,替換掉原來的ccdB基因;經(jīng)菌落PCR篩選轉(zhuǎn)化子,其陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證,將正確的克隆進(jìn)行高純度質(zhì)粒抽提;利用Admax系統(tǒng),將3種目的穿梭質(zhì)粒、1種陰性對(duì)照穿梭質(zhì)粒分別與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中重組獲得病毒后進(jìn)行小量擴(kuò)增及病毒滴度測(cè)定;利用Slfn1過表達(dá)腺病毒質(zhì)粒中目的基因攜帶Flag標(biāo)簽,通過Western Blot檢測(cè)Slfn1過表達(dá)腺病毒質(zhì)粒與靶點(diǎn)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞中Flag的表達(dá),觀察靶點(diǎn)質(zhì)粒對(duì)Slfn1表達(dá)的影響。2、通過組織塊貼壁法原代培養(yǎng)VSMCs,應(yīng)用倒置相差顯微鏡對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,使用免疫熒光法對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。3、使用最適感染復(fù)數(shù)的shRNA-Slfn1(1)重組腺病毒轉(zhuǎn)染VSMCs 48h后,應(yīng)用倒置熒光顯微鏡觀察EGFP的表達(dá)情況,并使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率,通過PCR檢測(cè)Slfn1 mRNA的表達(dá),最后使用CCK-8檢測(cè)Slfn1的沉默表達(dá)對(duì)VSMCs增殖的影響。結(jié)果:1、經(jīng)菌落PCR鑒定獲得陽(yáng)性克隆并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證正確,表明構(gòu)建質(zhì)粒成功;經(jīng)腺病毒包裝及病毒擴(kuò)增與純化后,shRNA-Slfn1(1)、shRNA-Slfn1(2)、shRNA-Slfn1(3)及NC-shRNA的病毒滴度分別為1.0x1011 ifu/ml,2.5x1011 ifu/ml,6.3x1010 ifu/ml,5.5x1010 ifu/ml。Western Blot證實(shí)shRNA-Slfn1(1)和shRNA-Slfn1(3)能顯著降低293T細(xì)胞中Flag的表達(dá),確定shRNA-Slfn1(1)及shRNA-Slfn1(3)為目的質(zhì)粒。2、原代培養(yǎng)第4-6天時(shí),部分組織塊周圍開始有長(zhǎng)梭形細(xì)胞爬出;第7-9天時(shí),組織塊周圍細(xì)胞爬出較少的呈網(wǎng)狀生長(zhǎng),細(xì)胞爬出較多的呈漩渦狀生長(zhǎng),致密排列呈束狀;第10-14天時(shí),細(xì)胞呈放射狀、典型的“峰—谷”樣結(jié)構(gòu),相互融合達(dá)80%左右即可傳代,此時(shí)傳代細(xì)胞相比原代細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯加快,細(xì)胞變大,折光性減弱。免疫熒光染色鑒定可見VSMCs特異性的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SM-actin)表達(dá),表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在95%以上。3、shRNA-Slfn1(1)重組腺病毒轉(zhuǎn)染VSMCs48h后,倒置熒光顯微鏡下的EGFP、流式細(xì)胞儀檢測(cè)的轉(zhuǎn)染效率均達(dá)80%以上;PCR結(jié)果顯示:Slfn1干擾組與Slfn1干擾對(duì)照組相比,Slfn1 mRNA表達(dá)量明顯減少;CCK-8結(jié)果顯示:使用shRNA-Slfn1重組腺病毒載體降低VSMCs中Slfn1基因的表達(dá)后,與對(duì)照組相比促進(jìn)VSMCs的增殖。結(jié)論:1、成功構(gòu)建了大鼠shRNA-Slfn1的重組腺病毒載體。2、shRNA-Slfn1(1)重組腺病毒對(duì)原代大鼠VSMCs具有干擾作用且干擾效率較高,干擾VSMCs中Slfn1基因的表達(dá)促進(jìn)VSMCs的增殖。
【學(xué)位單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：Q78;R329.2
【部分圖文】：

圖 1-1 穿梭質(zhì)粒圖譜Fig. 1-1 Map of Shuttle plasmidAgeI 和 EcoRI 酶酶切 U6 啟動(dòng)子下游的 ccdB 毒性基因，酶

對(duì)照（空載體質(zhì)粒）；2 為 DNAMarker,從上到下的方向依次為 2 000 100 bp；3~10 為挑取的 8 個(gè)轉(zhuǎn)化子。圖 2-2 菌落 PCR 鑒定陽(yáng)性克隆Fig. 2-2 Bacterial colonies were identified by PCR.

Fig. 2-2 Bacterial colonies were identified by PCR.2.2.2 測(cè)序鑒定重組穿梭質(zhì)粒挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，通過 Chromas 測(cè)序軟件分析顯示所插入的 3對(duì) shRNA 及 1 對(duì)對(duì)照序列與設(shè)計(jì)序列完全一致，表明目的穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功：
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2839951