發(fā)布時間：2020-09-11 08:13

　　 研究背景和目的:紅系發(fā)育是指造血干細胞在造血微環(huán)境中分化為成熟紅細胞的全過程。這一過程大致可分為紅系發(fā)育早期階段、紅系發(fā)育終末階段和網(wǎng)織紅細胞成熟三個階段,并伴隨著一系列獨特的變化,包括細胞體積的減小、血紅蛋白合成增加、染色質(zhì)固縮以及脫核等。因此,紅系發(fā)育需要精細而復(fù)雜的調(diào)控。既往對紅系發(fā)育的分子調(diào)控機制研究主要集中在促紅細胞生成素(Erythropoietin,EPO)及其受體(Erythropoietin receptor,EPOR)、糖皮質(zhì)激素及其受體、轉(zhuǎn)錄因子GATA1、GATA2及KLF1等和表觀遺傳修飾如小RNA(microRNA,miRNA)、長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)、DNA甲基化以及乙�；揎椀确矫�。但關(guān)于激酶在這一調(diào)控過程的研究仍較少。PIM2(Proviral Integrations of Moloney virus 2)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到重要的抗凋亡和促進增殖的作用,而其在人紅系發(fā)育中的作用尚不明確。為了研究其功能,我們利用shRNA敲低技術(shù)在人CD34~+造血干細胞階段敲低PIM2的表達并定向紅系分化,檢測其在紅系分化過程中的作用。同時,為了觀察PIM2在K562、HEL和TF1這三種血液惡性腫瘤細胞系中的功能,我們利用相同的方法敲低PIM2的表達,并利用Hemin誘導(dǎo)其向紅系分化,檢測在此過程中PIM2對血液惡性腫瘤細胞系向紅系分化進程的影響。課題的完成將有助于闡釋PIM2在正常生理及疾病過程中的作用及潛在的分子機制。研究方法:利用RNA-seq分析PIM2在胎肝來源、外周血來源及臍帶血來源的CD34~+細胞定向分化的紅系各期細胞的表達譜,并利用qRT-PCR和Western Blot的方法驗證PIM2在臍帶血CD34~+細胞定向分化的紅系細胞中的表達;利用臍帶血CD34~+造血干細胞培養(yǎng)巨噬細胞、粒細胞等,利用qRT-PCR檢測PIM2的表達。為了研究PIM2在紅系發(fā)育過程中的作用,我們設(shè)計了可敲低PIM2表達的shRNA,在臍帶血CD34~+造血干細胞階段敲低PIM2的表達,定向紅系分化;利用qRT-PCR和Western Blot檢測敲低效率,流式細胞術(shù)檢測紅系早期分化、終末分化、增殖、周期、凋亡以及脫核等;細胞計數(shù)檢測紅系細胞的增殖、Cytospins觀察不同培養(yǎng)天數(shù)的紅系細胞形態(tài)的改變。在檢測的過程中細胞出現(xiàn)了明顯的凋亡現(xiàn)象,進一步利用AO-EB染色確認細胞凋亡。根據(jù)PIM2敲低后凋亡明顯增加的表型我們運用流式細胞術(shù)檢測P53的蛋白表達水平以及qRT-PCR檢測P53下游基因BAX和P21等的表達以及調(diào)控P53蛋白穩(wěn)定性的MDM2的表達。Western Blot驗證P53及其下游P21和BAX的表達。利用相同的方法,在K562、HEL和TF1這三種血液惡性腫瘤細胞系中敲低PIM2的表達。利用流式細胞術(shù)、聯(lián)苯胺染色等方法,探究PIM2敲低對這三種細胞系的增殖、分化以及凋亡的影響。結(jié)果和結(jié)論:RNA-seq結(jié)果顯示PIM2在胎肝來源、外周血來源以及臍帶血來源的CD34~+造血干細胞定向紅系分化的各期細胞中的表達均是逐漸升高,在Ortho-E期的表達均是最高的。qRT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示PIM2的mRNA和蛋白水平在臍帶血CD34~+造血干細胞來源的紅系細胞分化中表達逐漸升高。qRT-PCR結(jié)果顯示Ortho-E期PIM2的表達均高于常見的血液系統(tǒng)細胞和其他常見人類細胞。細胞計數(shù)和流式結(jié)果顯示PIM2敲低不影響早期紅系分化和增殖,顯著延遲終末紅系分化。與對照組相比,敲低組終末紅系細胞的數(shù)目降低超過2倍,G0/G1期升高了約15%,敲低組的S期與正常組比較降低了約10%,凋亡細胞比例增加超過2.5倍。此外,PIM2敲低還導(dǎo)致紅系細胞的脫核比例明顯下降。利用流式細胞術(shù)我們發(fā)現(xiàn)P53的蛋白表達升高超過2倍。進一步利用qRT-PCR檢測P53的mRNA表達以及其下游基因BAX、P21、BAK和NOXA的表達,我們發(fā)現(xiàn)PIM2敲低導(dǎo)致P53下游基因表達水平均增加3倍以上,但不影響P53 mRNA的表達。Western Blot結(jié)果進一步顯示PIM2敲低后導(dǎo)致P53及其下游P21和BAX的表達明顯升高。MDM2可以降解P53蛋白,進一步我們利用qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)MDM2的表達下降超過50%。PIM2敲低對K562細胞增殖、分化以及凋亡無明顯影響。對HEL細胞分化有抑制、對細胞的凋亡和增殖無影響。對TF1細胞的增殖和凋亡無影響但促進了細胞的分化。PIM2敲低在正常紅系發(fā)育中具有階段性調(diào)控作用,對早期紅系細胞增殖以及分化無明顯影響,對終末紅系細胞增殖、分化和脫核起到重要的調(diào)控作用;其中PIM2敲低導(dǎo)致終末紅系細胞凋亡的主要原因可能是激活了P53介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡信號通路;與此同時PIM2敲低對惡性血液腫瘤細胞系向紅系分化時細胞增殖和凋亡無明顯影響。
【學位單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

不但能夠維持紅細胞獨特的雙面凹陷的圓盤形狀，使其能夠以最大限度地從周圍的環(huán)境中攝取足夠的氧氣的功能，而且賦予了紅細胞強大的柔韌性和變形能力，這些均為紅細胞行使運輸氧氣提供了強大的生理功能保障。與此同時，紅細胞中含有大量豐富的血紅蛋白，這種紅細胞特有的蛋白能夠結(jié)合在肺部與氧結(jié)合形成氧合血紅蛋白，是紅細胞能夠攜帶氧氣的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[3,4]。紅細胞的生成是個復(fù)雜的過程，經(jīng)歷了多能干細胞向紅系分化和紅系祖細胞的繼續(xù)分化直至發(fā)育成熟等過程。紅系發(fā)育是造血發(fā)育的重要分支，主要可分成三個階段：1、早期發(fā)育階段：主要指從造血干細胞發(fā)育生成 BFU-E 和 CFU-E的階段；2、終末分化階段：主要是指從形態(tài)上可分辨的原始紅細胞經(jīng)過早幼紅細胞、中幼紅細胞和晚幼紅細胞，進而脫核生成網(wǎng)織紅細胞的過程；3、網(wǎng)織紅細胞成熟階段：網(wǎng)織紅細胞進入血液循環(huán)逐漸成熟[5]。其中早幼紅細胞階段便可產(chǎn)生具有攜氧功能的血紅蛋白，而晚幼紅細胞階段主要發(fā)生的事件是細胞核的脫出。血紅蛋白的生成以及細胞核的排出是紅細胞分化并逐漸走向成熟的重要標志，見圖 1.1。

圖 1.2 PIM 蛋白亞型示意圖（引自：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/med.21284）人的 PIMs 激酶也是彼此高度同源：在氨基酸水平上，PIM2 和 PIM1 53%是相同的，而 PIM2 和 PIM3 有 65%的同源性，三個 PIM 激酶的一些功能冗余在體外[10,11]和體內(nèi)[12,13]已被證明。已經(jīng)有報道稱 PIM1 和 PIM2 的翻譯起始位點不同，產(chǎn)生了具有不同分子量的亞型。PIM1 激酶編碼 34kDa 和 44kDa 同種型，但這兩種型的激酶活性是相同的。PIM2 以三種同種型(34kDa、37kDa 和 40kDa)存在，但是對它們?nèi)齻�蛋白質(zhì)功能或相互作用的差異并沒有很多的解釋和討論。PIM3僅為單一的同種型。PIM 激酶亞型普遍表達，但具有一些組織特異性：PIM1 在造血細胞、胃、頭頸部和前列腺腫瘤中有高表達。PIM2 在淋巴和腦組織中表達很高；PIM3 在乳腺癌、腎癌和腦組織中高表達。1.2.2 PIM2 調(diào)節(jié)的信號通路PIM 激酶的表達不僅受到不同類型的調(diào)控因子所控制，而且還受到轉(zhuǎn)錄水

圖 1.3 PIM 蛋白激酶激活模式圖（引自：https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0006-2952(12)00649-1）PIM2 基因是作為莫洛尼小鼠白血病病毒的前整合位點最早被發(fā)現(xiàn)的。小鼠的 PIM2 基因首先被我們克隆出來，接著人、青蛙、牛、老鼠以及斑馬PIM2 基因也被逐一的克隆出來[15,16]。根據(jù) PIM2 基因的特性，PIM2 編碼的是一種高度保守的絲/蘇氨酸激酶，PIM2 基因的表達水平不僅僅是受到激素胞因子和分裂素等這些非自身條件的影響，同時也受到其自身轉(zhuǎn)錄水平的錄后水平的、翻譯水平的以及翻譯后水平的自身因素的影響，就目前以上表明 PIM2 蛋白和大部分的細胞功能如其凋亡、增殖、分化和腫瘤發(fā)生以及發(fā)展均是緊密關(guān)聯(lián)的[17]。隨著人們對腫瘤發(fā)病學不斷深入的研究，絲/蘇氨酶 PIM2 在如何抑制腫瘤細胞凋亡的機制這方面得到有越來越多的關(guān)注。通較與不同癌基因作用和 PIM2 的作用機制，我們發(fā)現(xiàn)，PIM2 具有強大而廣抗凋亡作用，雖然目前僅僅對 PIM2 作用的機制作了初步的判斷，但仍可以后 PIM2 的研究提供一些思路。

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7 司聚同;邢錄洲;孫紅;陳德高;王永潮;;I_D基因:一個廣譜性細胞分化抑制基因[A];中國細胞生物學學會第五次會議論文摘要匯編[C];1992年

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8 ;美試驗用腫瘤細胞治中風[N];新華每日電訊;2000年

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