人口老齡化會(huì)面臨各種退行性疾病的高發(fā)。其中,神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病占有很大的比例。本課題主要圍繞帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的細(xì)胞療法展開研究,為之后研究中腦DA神經(jīng)元的發(fā)育路徑,PD發(fā)病機(jī)制和開展PD的細(xì)胞療法奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。PD的發(fā)病機(jī)制主要是中腦黑質(zhì)(substantia nigra pars compacta,SNc)區(qū)域DA神經(jīng)元的死亡導(dǎo)致多巴胺(dopamine,DA)分泌量減少。開展PD的細(xì)胞治療,最重要的是要得到源源不斷的供體細(xì)胞,即DA神經(jīng)前體細(xì)胞。本課題主要研究目標(biāo)是建立DA神經(jīng)元的分化體系,為PD的細(xì)胞療法提供細(xì)胞。采用的策略是將人胚胎干細(xì)胞(human Embryonic Stem Cells,hESCs)定向分化為DA前體細(xì)胞從而得到供體細(xì)胞。首先,通過添加特定組合的因子將hESCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)底板細(xì)胞(neural floor plate cells,NFP),這部分細(xì)胞能夠表達(dá)神經(jīng)底板細(xì)胞的標(biāo)志物L(fēng)MX1A,FOXA2,OTX2。然后,經(jīng)過FGF8等因子的誘導(dǎo),神經(jīng)底板細(xì)胞能夠分化為DA前體細(xì)胞,這些細(xì)胞能夠表達(dá)中腦的標(biāo)志物L(fēng)MX1A,FOXA2,EN1。我們將其體外培養(yǎng)發(fā)成熟為多巴胺神經(jīng)元后,它能夠表達(dá)成熟DA神經(jīng)元的標(biāo)志物TH,TUJ1。為了探究不同hESCs的分化潛力是否存在差異,我們采用了12株hESCs進(jìn)行了DA的分化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,不同hESCs分化產(chǎn)生的DA神經(jīng)前體細(xì)胞的效率是不同的,并篩選出了一株DA分化潛力較高h(yuǎn)ESCs,為DA的分化提供種子細(xì)胞。目前建立的DA神經(jīng)元的化體系仍有不足之處。第一個(gè)不足之處是:DA前體細(xì)胞的標(biāo)志物L(fēng)MX1A的表達(dá)比例過低。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)LMX1A在發(fā)育上是由WNT通路調(diào)控的,而CHIR99021是WNT通路的激活劑,所以我們利用了H9-LMX1A的報(bào)告細(xì)胞系對CHIR99021的最適濃度進(jìn)行了篩選,進(jìn)而上調(diào)LMX1A的表達(dá)水平。第二個(gè)不足之處是試劑不符合臨床要求。由于基礎(chǔ)級B27中含有BSA成分,我們更換為臨床級B27。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明臨床級B27可以較好的取代基礎(chǔ)級B27。第三個(gè)不足之處是DA神經(jīng)元的分化效率較低。本課題使用兩種方法來提高DA神經(jīng)元的分化效率。一種提高效率的方法是通過延長兩種營養(yǎng)因子GDNF和TGFβ3的作用時(shí)間來為DA神經(jīng)元提供分化所需的營養(yǎng)物質(zhì),進(jìn)而提高LMX1A,FOXA2,EN1,TH,TUJ1的表達(dá)比例。另一種方法是在ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的過程中,通過降低高SHH的濃度,同時(shí)加入SHH的激活劑PP來增強(qiáng)腹側(cè)化程度來提高DA神經(jīng)元的分化效率。從分化成本上看,SHH是一種蛋白質(zhì),價(jià)格較貴,這樣也可以減少DA神經(jīng)元的分化的成本,這為后續(xù)大量提供DA細(xì)胞治療PD提供了很大的幫助。綜上所述,本課題主要包括三個(gè)部分:DA神經(jīng)元分化體系的建立,不同hESCs向DA分化潛力的差異性研究,DA神經(jīng)元分化體系的優(yōu)化。這不僅為PD的細(xì)胞治療提供了充足的供體細(xì)胞,還為DA分化體系的優(yōu)化提供了寶貴經(jīng)驗(yàn)。
【學(xué)位單位】：曲阜師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

帕金森�。≒arkinson’sdisease，PD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生退行性病變的一類疾患者會(huì)出現(xiàn)身體震顫、肌肉僵直、身體姿勢不能保持平衡等的運(yùn)動(dòng)癥狀和嗅覺發(fā)生便秘、睡眠行為和精神方面異常等的非運(yùn)動(dòng)方面的癥狀，嚴(yán)重影響了患者的工作和生1.2 發(fā)病機(jī)制多巴胺神經(jīng)元主要分布于嗅球到中腦的區(qū)域（圖 1.1）。中腦區(qū)域的多巴胺神經(jīng)元有三群，分別位于紅核后區(qū)（A8），黑質(zhì)致密部（substantia nigra compacta pars，SN（A9），腹側(cè)被蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTN）（A10）[38]。其中位于的神經(jīng)元，主要投射到背外側(cè)紋狀體的尾狀核和殼核，其退行性病變將導(dǎo)致 PD[3]。SNc 區(qū)域的神經(jīng)元發(fā)出的上行纖維投射到紋狀體，形成黑質(zhì)—紋狀體通路并分泌和釋放多巴胺，區(qū)域病變是造成帕金森癥的直接原因。VTN 區(qū)域的 DA 神經(jīng)元投射至伏隔核的邊緣形成中腦邊緣葉通路，它的過度活躍與精神分裂癥及藥物成癮有關(guān)。紅核后區(qū) DA 神投射至大腦前額葉皮層，與情緒和動(dòng)機(jī)有關(guān)。

6圖 1.2 多巴胺神經(jīng)元的分化策略[28]Figure1.2 Protocols for the differentiation of mDAneurons.[28]多項(xiàng)研究證實(shí)，只有中腦區(qū)域特異性神經(jīng)細(xì)胞可以在移植部位很好的生存并起功能，雜質(zhì)細(xì)胞會(huì)影響 TH+神經(jīng)元數(shù)量和行為改善效果。而且，EN1+的中腦特異多巴胺神經(jīng)細(xì)胞移植后在體內(nèi)所生成 TH+神經(jīng)元的數(shù)量、體積及密度都是最佳的。因此，EN1 作為中腦黑

一定可以實(shí)現(xiàn)這一目的，帕金森病這類由特定細(xì)胞病變引起的疾病將能通過細(xì)胞替代得到有效治療。由于前述臨床級干細(xì)胞、功能性 DA 神經(jīng)元獲得技術(shù)取得重要進(jìn)展，臨床級別條件分化的 DA 神經(jīng)元在嚙齒類和非人靈長類 PD 模型中顯示出令人鼓舞的結(jié)果，基于臨床級干細(xì)胞分化的 DA 神經(jīng)元移植治療帕金森病的臨床試驗(yàn)條件已經(jīng)成熟[17,29]。但是，這種治療方法的推廣和普及尚面臨一定的問題，需要大量的臨床前和臨床研究對細(xì)胞治療的安全性和有效性進(jìn)行全面評價(jià)。1. 細(xì)胞移植能否成為常規(guī)由于帕金森病的發(fā)病部位的特殊性和行使功能的重要性，治療上存在許多困難。要用細(xì)胞移植的方式治療帕金森病，需要通過神經(jīng)外科手術(shù)將細(xì)胞遞送到紋狀體區(qū)，特別是豆?fàn)詈说臍げ�。因此，即使干�?xì)胞治療的安全性和有效性得到充分的驗(yàn)證，如何進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)胞治療的途徑，盡可能減少手術(shù)創(chuàng)傷，是有效推動(dòng)細(xì)胞移植治療廣泛應(yīng)用于臨床的重要前提之一。2. 哪種細(xì)胞來源更可能用于移植針對退行性變的細(xì)胞替代治療，將來主要會(huì)面臨著兩種選擇（圖 1.3，圖 1.4），是用胚胎干細(xì)胞分化的 DA 神經(jīng)元，還是用自體細(xì)胞進(jìn)行重編程或轉(zhuǎn)分化獲得個(gè)性化的 DA 神經(jīng)元進(jìn)行移植。

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本文編號：2816275