【摘要】：作為機體抵抗病原微生物入侵的第一道防線,天然免疫系統(tǒng)主要通過一系列模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)識別結構上較保守的病原體相關分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)或探測自身異常細胞來源的危險相關分子模式(danger associated molecular pattern,DAMP)以監(jiān)控病原體感染或感知細胞生存壓力。模式識別受體被激活后將進一步活化相應下游信號通路,最終激活NF-κB、AP-1和IRF等轉錄因子以驅動炎性細胞因子、趨化因子及干擾素的轉錄活化,殺傷并清除入侵病原體或自身異常的組織細胞,保護機體健康。翻譯后修飾(post-translational modification,PTM)是蛋白質功能調控的重要方式,其中泛素化修飾由E1-E2-E3泛素酶系統(tǒng)與去泛素化酶共同調節(jié),在抗原提呈、細胞分化、免疫防御與炎癥等諸多免疫過程中扮演重要角色。泛素是由76個氨基酸殘基構成的高度保守的小分子多肽,單體分子量為8.6kDa,可通過本身Lys 6、11、27、29、33、48、63七個賴氨酸殘基或頭尾相連形成線性泛素化修飾。目前研究最為成熟的是介導蛋白酶體途徑降解的K48連接泛素化修飾以及與蛋白激酶活化相關的K63連接泛素化修飾。去泛素化酶能夠與泛素修飾系統(tǒng)共同調控某一蛋白位點的泛素化水平,由于泛素可以多種方式多聚化偶聯(lián),在蛋白質功能調節(jié)過程中作用廣泛且重要。去泛素化酶分類上屬于蛋白水解酶超家族,家族成員眾多,絕大多數(shù)為半胱氨酸蛋白酶,但功能和機制研究仍然不十分完善,其在天然免疫應答調控中的作用仍有待進一步研究。在本課題中,我們通過去泛素化酶家族小干擾RNA(siRNA)文庫去篩選并試圖發(fā)現(xiàn)在天然免疫細胞抗病毒感染模型中具有顯著功能的潛在研究對象。針對篩選體系所采用的VSV、SeV和HSV-1感染模型,我們分別篩選得到了一系列調控抗病毒天然免疫信號的潛在研究對象,其中一些已被報道并與我們所篩選得到的效應一致,這印證了我們篩選體系的可行性。對于大部分在天然免疫調控研究領域尚未被報道的去泛素化酶基因,我們優(yōu)先選擇在不同種類病毒感染模型中具有一致且最顯著差異表型的BRCA1相關蛋白1(BRCA1-associated protein 1,BAP1)作為研究對象,以期發(fā)現(xiàn)具有普適性的天然免疫抗病毒調控機制。已有研究表明BAP1參與了細胞周期、分化、轉錄和DNA損傷修復等許多重要生命過程,而BAP1的突變會提高黑色素瘤、間皮瘤、腎細胞癌等多種惡性腫瘤的發(fā)病幾率,但BAP1在天然免疫應答調控的作用尚不清楚,值得進一步研究。通過體外功能實驗,我們發(fā)現(xiàn)BAP1能夠顯著上調病毒感染與外源性核酸模擬物誘導的I型干擾素的表達和分泌,增強細胞抗病毒感染能力并顯著抑制病毒胞內復制增殖。由于BAP1基因缺陷小鼠胚胎致死,即使髓系特異性敲除也會引發(fā)髓系細胞白血病,因而我們嘗試利用慢病毒感染野生型小鼠肺臟的方法構建了BAP1肺臟特異性過表達及敲低小鼠模型。通過體內肺臟流感病毒感染模型,我們發(fā)現(xiàn)BAP1能夠誘導I型干擾素與炎癥因子的分泌并增強干擾素刺激基因的表達,從而抑制流感病毒在肺臟的復制增殖。此外,BAP1可以緩解流感病毒感染導致的肺組織炎性細胞浸潤及小鼠體重減輕,能夠延長致死劑量感染小鼠的生存期并提高其生存率。在機制研究中,通過干擾原代巨噬細胞中BAP1的表達,我們發(fā)現(xiàn),BAP1的表達下調會顯著抑制病毒感染誘導的IRF3的磷酸化而對其他信號通路分子無明顯影響。通過熒光素酶報告基因實驗我們發(fā)現(xiàn),BAP1能有效增強IRF3及其上游信號通路分子誘導的IFNβ基因表達的活化。通過構建BAP1截短體結合報告基因實驗,BAP1對IFNβ基因表達的活化效應依賴于其泛素化酶活性及核定位。進一步實驗發(fā)現(xiàn),BAP1能夠促進病毒刺激下IRF3二聚化及核轉位。利用外源性免疫共沉淀篩選信號通路分子,BAP1能夠與IRF3顯著相互作用,我們進一步在原代巨噬細胞中驗證了內源性BAP1與IRF3的結合。利用BAP1截短體進行免疫共沉淀實驗,結果表明BAP1與IRF3的相互作用主要依賴于BAP1 UCH-H區(qū)域。接下來的實驗證明,BAP1的表達降低會促進IRF3蛋白酶體途徑降解,并進一步驗證BAP1能夠下調IRF3 K48泛素化修飾水平而對其他類型泛素化修飾無明顯影響。為了進一步明確BAP1的作用機制,我們利用分離胞漿胞核組分后免疫共沉淀的方式發(fā)現(xiàn)二者均見BAP1與IRF3的相互作用,但胞核中結合隨病毒感染增強。值得注意的是,我們發(fā)現(xiàn)病毒感染誘導的IRF3 K48泛素化修飾主要發(fā)生在胞核組分中,并且BAP1主要抑制胞核中IRF3的降解。進一步實驗發(fā)現(xiàn),能與IRF3相互作用且具有去泛素化酶活性的BAP1 UCH-H截短體由于缺乏入核能力并不能有效抑制核內IRF3的K48泛素化修飾及降解。查詢已有文獻報道,未見IRF3 K48泛素化修飾明確位點,因此挑選人鼠間保守的14個潛在泛素化賴氨酸位點構建Lys-Arg點突變體。實驗結果表明Lys77和Lys87是IRF3 K48泛素化修飾的關鍵位點,突變后顯著抑制IRF3降解,構建雙位點突變體后實驗發(fā)現(xiàn),IRF3 K77/87R雙位點突變較K77R K87R單位點突變進一步抑制IRF3降解并增強IFNβ報告基因的活化,但對病毒感染誘導的IRF3核轉位無明顯差異。利用野生型及單、雙位點IRF3突變體進行免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn),過表達BAP1可以下調WT IRF3及IRF3 K87R點突變體K48泛素化修飾水平而對IRF3 K77R及K77/87R突變體K48泛素化修飾水平無明顯影響,這一結果提示BAP1特異性作用于Lys77位點去泛素化修飾。為了進一步明確負責IRF3 Lys77位點K48泛素化修飾的E3泛素連接酶,我們篩選已被報道IRF3 K48連接泛素化修飾E3,發(fā)現(xiàn)UBE3C能夠顯著增強Lys77位點的泛素化水平,TRIM26能夠增強Lys87位點的泛素化水平。在病毒感染早期BAP1明顯升高而在后期逐漸恢復正常水平,而UBE3C表達水平晚于BAP1也有所升高并最終恢復到正常水平。我們的研究提示,在病毒急性感染期,BAP1表達升高并抑制核內IRF3 K48連接泛素化修飾介導的降解以放大抗病毒免疫效應;在感染后期,UBE3C表達逐漸增高并逆轉BAP1的促炎效應,使IRF3活化恢復到正常水平以免過度應答損傷機體。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)了抑癌基因BAP1正向調控抗病毒天然免疫應答的新功能,鑒定出抗病毒天然免疫信號通路中關鍵轉錄因子IRF3上能夠被K48泛素化修飾的位點Lys77和Lys87,同時揭示了E3泛素連接酶UBE3C能夠與BAP1拮抗調節(jié)IRF3的新機制,進一步完善了IRF3表達水平與功能的調控網(wǎng)絡,同時也為進一步理解BAP1的抑癌機制提供了新思路,為干預癌癥與病毒感染提供了潛在作用靶點。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R392
【圖文】：

pcDNA3.1/Myc(-)B質粒圖譜

pMIR-REPORT質粒圖譜

pRL-Renilla-TK熒光素酶內參質粒圖譜

【相似文獻】

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