【摘要】：研究背景我國每年新生兒出生缺陷率為5.6%左右,出生缺陷的病因復雜,遺傳因素和環(huán)境因素均可導致出生缺陷的發(fā)生。妊娠期微生物感染是環(huán)境因素主要種類之一,金黃色葡萄球菌(金葡菌,S.aureus)是細菌感染性疾病中最常見的病原菌之一,也是導致孕婦不良妊娠結局及胎兒發(fā)育異常的重要因素。葡萄球菌腸毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)為金葡菌的重要致病物質之一,既是一種毒素性致病物質,也是超抗原家族中最常見、最重要的一種超抗原。導師課題組前期研究發(fā)現,妊娠期孕鼠給予SEB可明顯影響子代鼠中樞及外周CD4/CD8T細胞的構成比例,但有關妊娠期孕鼠給予SEB對子代鼠T細胞起平衡調節(jié)作用的CD4~+CD25~+FoxP3~+Treg細胞(以下統(tǒng)稱“Treg細胞”)影響的研究,國內外尚無報道。本項目擬研究妊娠期孕鼠給予SEB對新生及成年子代鼠胸腺及外周血Treg細胞的影響,用流式細胞術檢測子代鼠胸腺及外周血中Treg細胞的數量;用ELISA法檢測外周血中IL-10和TGF-β的含量;用實時定量PCR和Western blot檢測FoxP3的mRNA和蛋白水平。其結果將為探討SEB與有關免疫性疾病的發(fā)生機理關系、提高人口健康和出生質量具有極其重要的價值。目的研究妊娠期孕鼠注射SEB對其子代鼠胸腺及外周血中Treg細胞的影響。方法1.建立妊娠期孕鼠模型及注射SEB成年雌雄SD大鼠(雌性約50只,雄性約20只)按1:1比例于18:00合籠,次日發(fā)現陰栓后即認為雌鼠已受孕,記為妊娠第一天(gestational day 1,GD1)。在GD16,孕鼠隨機分為兩組,實驗組孕鼠通過尾靜脈注射0.3ml 50μg/ml SEB,對照組給予同等體積的PBS,然后讓孕鼠繼續(xù)妊娠至孕期滿,待自然分娩后,取一部分新生子代鼠進行相應的實驗研究,另一部分讓其繼續(xù)生長至成年期進行相應的實驗研究。2.實驗分組2.1在新生子代鼠研究中,分為實驗組和對照組。實驗組為GD16給予SEB注射的孕鼠分娩得到的新生子代鼠,標記為“新生鼠SEB組”。對照組為給予同等體積PBS注射的孕鼠分娩得到的新生子代鼠,標記為“新生鼠PBS組”。2.2在成年子代鼠研究中,分為實驗組和對照組。實驗組為妊娠期注射SEB孕鼠所產的成年子代鼠,標記為“成年鼠SEB組”;對照組為妊娠期注射同等體積PBS孕鼠所產的成年子代鼠,標記為“成年鼠PBS組”。2.3在成年子代鼠再次應答的研究中,分為四組。妊娠期給予PBS注射的孕鼠所產的成年子代鼠,在成年期分別再次給予PBS或SEB注射,相應記為“PBS+PBS組”及“PBS+SEB組”。妊娠期給予SEB注射的孕鼠所產的成年子代鼠,在成年期分別再次給予PBS或SEB注射,相應記為“SEB+PBS組”及“SEB+SEB組”。3.妊娠期孕鼠注射SEB對新生子代鼠Treg細胞的影響研究3.1妊娠期孕鼠注射SEB對新生子代鼠胸腺和外周血Treg細胞數量的影響研究妊娠期孕鼠注射SEB,在新生子代鼠出生后第1、3、5天,取其胸腺制成單細胞懸液,并獲取外周血,用淋巴細胞分離液分離出單個核細胞,用熒光標記的抗體(CD3-FITC,CD4-APC,CD25-PE,FoxP3-percy5.5)進行胞內外染色后,采用流式細胞儀檢測其胸腺和外周血中Treg細胞的比例,并計算Treg細胞的絕對數量。3.2妊娠期孕鼠注射SEB對新生子代鼠第五天外周血中細胞因子的影響研究孕鼠于妊娠期注射SEB,待其自然分娩,在新生子代鼠出生后第5天斷頭獲取其抗凝血液,離心得到血漿,通過ELISA法測定IL-10和TGF-β的含量。3.3妊娠期孕鼠注射SEB對新生子代鼠FoxP3蛋白及mRNA水平的影響研究獲得新生子代鼠胸腺及外周血單個核細胞,抽提其總RNA并逆轉錄為cDNA,通過real-time PCR檢測細胞中FoxP3的mRNA水平;提取樣本中的總蛋白,采用western blot定量檢測FoxP3蛋白表達水平。4.妊娠期孕鼠注射SEB對成年子代鼠Treg細胞的影響研究4.1妊娠期孕鼠注射SEB對成年子代鼠胸腺和外周血Treg細胞數量的影響研究妊娠期孕鼠注射SEB后,待其新生子代鼠生長至成年(3-5個月),取其胸腺制成單細胞懸液,并獲取外周血,用淋巴細胞分離液分離出單個核細胞,用熒光抗體(CD3-FITC,CD4-APC,CD25-PE,FoxP3-percy5.5)染色后,流式細胞儀檢測Treg細胞的比例,并計算Treg細胞的絕對數量。4.2妊娠期孕鼠注射SEB對成年子代鼠外周血中細胞因子的影響研究孕鼠于妊娠期注射SEB,待新生子代鼠生長至成年后,抽取腹主動脈血液并抗凝,離心獲得血漿,通過ELISA法測定IL-10和TGF-β的含量。4.3妊娠期孕鼠注射SEB對成年子代鼠FoxP3蛋白及mRNA水平的影響研究獲得成年子代鼠胸腺及外周血單個核細胞,抽提其總RNA并逆轉錄為cDNA,通過real-time PCR檢測細胞中FoxP3的mRNA水平;提取樣本中的總蛋白,采用western blot定量檢測FoxP3蛋白表達水平。5.再次給予SEB對成年子代鼠Treg細胞的影響研究妊娠期給予SEB或PBS孕鼠的成年子代鼠,分別再次給予SEB或PBS尾靜脈注射,5天后獲取成年子代鼠的胸腺和外周血進行如下研究。5.1再次給予SEB對成年子代鼠胸腺和外周血中Treg細胞數量的影響研究淋巴細胞分離液分離胸腺及外周血單個核細胞,通過熒光標記的抗體(CD3-FITC,CD4-APC,CD25-PE,FoxP3-percy5.5)進行胞內外染色,采用流式細胞儀檢測其Treg細胞的比例,并計算Treg細胞的絕對數量。5.2再次給予SEB對成年子代鼠外周血中細胞因子的影響研究抗凝的外周血離心后得到血漿,通過ELISA法測定成年子代鼠外周血中IL-10和TGF-β的含量。5.3再次給予SEB對成年子代鼠胸腺和外周血中FoxP3蛋白及mRNA水平的影響研究淋巴細胞分離液分離成年子代鼠胸腺及外周血獲得單個核細胞,抽提其總RNA并逆轉錄為cDNA,通過real-time PCR檢測該細胞中FoxP3的mRNA水平;通過提取樣本中的總蛋白,采用western blot定量檢測FoxP3蛋白表達水平。結果1.成功建立孕鼠模型合籠后次日發(fā)現陰栓即認為雌鼠已受孕。在GD16給予孕鼠尾靜脈注射15μg SEB,然后讓其繼續(xù)妊娠至孕期滿,待其自然分娩,則表明孕鼠模型建立成功,模型成功率70-80%。2.妊娠期孕鼠注射SEB對新生子代鼠Treg細胞的影響(1)妊娠期孕鼠注射SEB對出生后第1、3、5天新生子代鼠胸腺及外周血中Treg細胞的百分比并無影響,但明顯增加新生子代鼠胸腺及外周血中Treg細胞的絕對數量。(2)妊娠期孕鼠注射SEB明顯增加新生子代鼠第5天外周血中IL-10和TGF-β的含量。(3)妊娠期孕鼠注射SEB明顯增加出生后第1、3、5天新生子代鼠胸腺及外周血中FoxP3的mRNA及蛋白水平。3.妊娠期孕鼠注射SEB對成年子代鼠Treg細胞的影響(1)妊娠期孕鼠注射SEB對成年子代鼠胸腺及外周血中Treg細胞的百分比并無影響,但明顯增加成年子代鼠胸腺及外周血中Treg細胞的絕對數量。(2)妊娠期孕鼠注射SEB明顯增加成年子代鼠外周血中IL-10和TGF-β的含量。(3)妊娠期孕鼠注射SEB明顯增加成年子代鼠胸腺及外周血中FoxP3的mRNA及蛋白水平。4.再次給予SEB對妊娠期注射SEB孕鼠的成年子代鼠Treg細胞的影響(1)PBS+SEB組與PBS+PBS組比較,胸腺中Treg細胞的比例明顯升高,而SEB+SEB組與PBS+SEB組比較明顯降低。SEB+PBS組與PBS+PBS組比較、SEB+SEB組與PBS+SEB組比較,胸腺中Treg細胞絕對數明顯升高,而PBS+SEB組與PBS+PBS組比較、SEB+SEB組與SEB+PBS組比較明顯降低。PBS+SEB組與PBS+PBS組,SEB+PBS組與PBS+PBS組比較,外周血中Treg細胞的比例明顯升高。SEB+PBS組與PBS+PBS組、PBS+SEB組與PBS+PBS組比較,外周血中Treg細胞絕對數明顯升高,而SEB+SEB組與SEB+PBS組、SEB+SEB組與PBS+SEB組比較則降低。(2)SEB+PBS組、PBS+SEB組與PBS+PBS組比較外周血中IL-10和TGF-β的含量明顯升高,而SEB+SEB組與PBS+SEB組、SEB+PBS組比較明顯降低。(3)SEB+PBS組、PBS+SEB組與PBS+PBS組比較,胸腺和外周血中FoxP3的mRNA和蛋白水平明顯升高,而SEB+SEB組與PBS+SEB組、SEB+PBS組比較明顯降低。結論1.妊娠期孕鼠注射SEB可對其新生子代鼠中樞和外周的Treg細胞、轉錄因子FoxP3和細胞因子產生正向調節(jié)作用,使其升高。2.妊娠期孕鼠注射SEB對其成年子代鼠中樞和外周的Treg細胞、轉錄因子FoxP3和細胞因子產生正向調節(jié)作用,使其升高,且與新生子代鼠的變化趨勢一致,表明妊娠期孕鼠注射SEB對子代鼠Treg細胞的影響可以從新生期保留至成年期,形成印跡效應。3.妊娠期孕鼠注射SEB可改變成年子代鼠中樞和外周Treg細胞對再次給予SEB的應答能力。
【學位授予單位】：蚌埠醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R714;R-332
【圖文】：

結果1.妊娠期孕鼠注射 SEB 對新生子代鼠 Treg 細胞影響的研究1.1 妊娠期孕鼠注射 SEB 對新生子代鼠 Treg 細胞數量的影響流式檢測圖（圖 1）發(fā)現，妊娠期孕鼠注射 SEB 對新生子代鼠胸腺（圖 2A）及外周血（圖 3A）中 Treg 細胞的百分比并無影響，但明顯增加新生子代鼠胸腺（圖 2B）及外周血（圖 3B）中 Treg 細胞的絕對數量。

圖 2 妊娠期孕鼠注射 SEB 對新生子代鼠胸腺 Treg 細胞的影響.（注：A，Treg 百分比，B，Treg 絕對數，#，P＜0.05,*，P＜0.01）Fig2：Effects of SEB exposure in pregnant rats on thymus Treg cells in neonatal offspring.（Note：A,Percentage of Treg cells,B,The absolute number of Treg cells, #,P＜0.05,*,P＜0.01）圖 3 妊娠期孕鼠注射 SEB 對新生子代鼠外周血 Treg 細胞的影響.（注：A，Treg 百分比，B，Treg 絕對數，#，P＜0.05，*，P＜0.01）Fig3：Effects of SEB exposure in pregnant rats on peripheral blood Treg cells in neonataloffspring.

圖 2 妊娠期孕鼠注射 SEB 對新生子代鼠胸腺 Treg 細胞的影響.（注：A，Treg 百分比，B，Treg 絕對數，#，P＜0.05,*，P＜0.01）Fig2：Effects of SEB exposure in pregnant rats on thymus Treg cells in neonatal offspring.（Note：A,Percentage of Treg cells,B,The absolute number of Treg cells, #,P＜0.05,*,P＜0.01）

【參考文獻】

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2 李賓;吳福玲;馮學斌;孫大康;李營營;趙志旭;;呼吸道合胞病毒毛細支氣管炎患兒外周血CD4~+CD25~+調節(jié)性T細胞及IL-10、TGF-β檢測及意義[J];濱州醫(yī)學院學報;2011年06期

3 劉從森;劉婷婷;孔曉明;朱翔;劉勇;閔宏林;管俊昌;;妊娠母鼠靜脈注射葡萄球菌腸毒素B對胎鼠胸腺發(fā)育的影響[J];蚌埠醫(yī)學院學報;2011年06期

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本文編號：2798122