【摘要】：目的:朊病毒疾病是由朊蛋白錯誤折疊引起的一類神經(jīng)退行性疾病,也稱為傳染性海綿狀腦病。錯構的朊蛋白結構中α螺旋結構比例下降,β折疊結構比例上升,造成這種錯構朊蛋白積聚成纖維狀,引發(fā)神經(jīng)細胞的凋亡。這種錯構的朊蛋白被稱為朊病毒,可通過食物、血液等在動物中傳播,進入宿主內的朊病毒可誘導宿主正常朊蛋白錯構,從而完成疾病的傳染。朊病毒在小鼠和倉鼠之間傳播具有屏障作用,表現(xiàn)為實驗動物的發(fā)病的潛伏期延長,發(fā)病率低下。除了株系的原因之外,朊病毒的傳播屏障主要是由異源朊蛋白的氨基酸位點的差異造成的。小鼠和倉鼠存在11個氨基酸位點的不同,且每個位點對小鼠和倉鼠之間朊病毒傳播的影響程度不同。我們在倉鼠朊蛋白的基礎上構建了不同的向小鼠朊蛋白氨基酸突變的多位點突變體朊蛋白,利用PMC A技術和體外重組朊蛋白技術,探究不同位點組合能否跨越朊病毒在小鼠和倉鼠之間傳播的種屬屏障。方法:在合成的質粒模板上,設計多個位點的突變引物,由倉鼠向小鼠突變。得到的突變載體模板經(jīng)測序正確后,轉化進BL21大腸桿菌,挑選單克隆并進一步誘導表達重組朊蛋白。將得到的重組朊蛋白與小鼠朊病毒(PrP~(Sc))一起進行PM CA實驗,觀察小鼠朊病毒能否誘導多點位突變倉鼠朊蛋白產(chǎn)生錯構,通過PK消化處理PMCA產(chǎn)物檢測其PK抗性進行驗證。結果:成功構建了7個多點突變的重組朊蛋白基因,其中包括4個3突變位點、2個4突變位點和1個5突變位點。經(jīng)測序正確后,轉化大腸桿菌誘導表達,經(jīng)過Ni-NTA親和層析后得到重組蛋白。在配制底物體系后,與小鼠PrP~(Sc)進行P MCA實驗,檢驗轉化結果。結果顯示HaPrP(M111V-M138I-I204M)轉化的構象得到了經(jīng)PK消化后具有致病能力的17 kD片段,其他突變體都出現(xiàn)了經(jīng)PK消化后的無致病能力的14 kD片段。結論:PMCA結果顯示,經(jīng)過PK消化后,在7種突變體里面只有HaPrP(M111V-M138I-I204M)這個突變體得到了17 kD片段的致病構象,沒有出現(xiàn)無致病的14 kD片段無致病構象。而其他3突變體及更多位點的4突變體和5突變體既得到經(jīng)PK消化的無致病構象14 kD片段也得到了經(jīng)PK消化有致病構象的17 kD片段,這2種不同構象的同時存在可能不會使接種的動物患病,無法實現(xiàn)跨越種屬屏障。同時M111V、M138I和I204M與先前得到的影響小鼠-倉鼠朊病毒傳播的G54ins、I138M和M204I 3個位點結果并不完全一致。說明單個氨基酸位點作用并不是簡單的疊加效果,有可能這些位點還存在空間上的相互作用。本文通過重組朊蛋白和PMCA技術,得到了克服小鼠和倉鼠種屬屏障的3突變朊蛋白,闡述了小鼠和倉鼠朊病毒種屬間傳播的關鍵氨基酸位點,進一步驗證了構象選擇理論。
【學位授予單位】：華東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R373
【圖文】：

于蛋白質一級結構。除了氨基酸位點的不同之外，越來越多的研究表明朊病毒株系在傳播屏障里起重要作用。典型例子便是變異型克雅氏病 （variant CJD，vCJD）和散發(fā)型克雅氏�。╯poradic CJD，sCJD）對小鼠朊蛋白和人朊蛋白的不同傳染特點。兩者的氨基酸序列一致，vCJD 是通過 BSE 傳染得到的，而 sCJD 是自發(fā)形成的，兩者表現(xiàn)出不同的株系特點。其中，sCJD 可以穩(wěn)定傳染給表達人源朊蛋白的轉基因小鼠，但不能傳染給野生型小鼠；而 vCJD 可以高效傳給野生型小鼠朊蛋白[20]。此類發(fā)現(xiàn)引出了構象選擇學說[21-22]。該學說指出，所有的朊蛋白聚集體，只有一部分與宿主相兼容的才能在宿主體內具有致病作用。兩個物種之間兼容構象的重疊度解釋了傳播屏障的產(chǎn)生。在這個理論模型下，種屬屏障基本上和株系相關。傳播屏障也會由于同一物種的朊蛋白的多態(tài)性而發(fā)生，比如人類的 129 位點甲硫氨酸或纈氨酸的不同也會影響朊病毒的傳染和株系選擇[23]。

有 10 個氨基酸位點不同。正是這些氨礙�？蚣�，向倉鼠方向突變，構建 11 個小蛋白一起混合，放在 PMCA 條件下孵（圖 1.1）。說明不同氨基酸位點在小揭示了小鼠朊病毒和倉鼠朊病毒傳播204I 和 I138M 突變影響最大。鼠為框架，構建向小鼠方向突變的多位 PrPSc作為種子，進行孵育得到具有致病毒和倉鼠朊病毒之間的傳播屏障。由鼠朊蛋白片段的質粒后，我們設計了 5

15圖 1.5 點突變 PCR 產(chǎn)物鑒定Figure 1.5 Identification of site mutation PCR production合成的 pET-22b-HaPrP23-231 質粒上，為得到多突變體，我們設在每一輪單點突變后，挑 3 個單克隆菌落送測序，將得到的正確

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 鄒秋林,黃志良;淺說朊病毒[J];生物學教學;2001年02期

2 韓一們;陳廣潔;;朊病毒及其相關疾病的免疫學研究[J];生命的化學;2008年02期

3 李瀟;關于朊病毒引起瘋牛病傳染的證據(jù)[J];中國生物化學與分子生物學報;2005年01期

4 李忠秋,王君偉,劉春龍;朊病毒概述及其所致疾病研究[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2004年09期

5 王昱;一種可以過濾瘋牛病朊病毒的濾器[J];中國動物保健;2004年12期

6 駱亦奇,鄭伏英;朊病毒分子結構及其性質研究進展[J];大學化學;2003年04期

7 南木甲,商營利,劉思當;朊病毒及瘋牛病[J];山東畜牧獸醫(yī);2002年02期

8 李娜 ,賈向春;朊病毒易感性相關基因被證實[J];國外醫(yī)學.遺傳學分冊;2002年01期

9 趙克霞;朊病毒研究新進展[J];淮南師范學院學報;2002年03期

10 方元;朊病毒研究進展[J];病毒學報;2000年04期

相關會議論文 前10條

1 宋有濤;宋堯;游園園;張慧麗;李欣;;利用基因重組酵母細胞[GPSI~+]建立新型抗朊病毒藥物篩選模型[A];2008年中國微生物學會學術年會論文摘要集[C];2008年

2 崔香梅;吳曉東;王志亮;;人朊病毒核心片段的基因克隆、原核表達、蛋白純化和抗原性分析[A];人畜共患傳染病防治研究新成果匯編[C];2004年

3 高躍;丁壯;萬家余;高宏偉;;朊病毒的跨種屬傳播機制及公共衛(wèi)生安全意義[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會第十二次學術研討會論文集[C];2007年

4 高躍;馬青原;劉文森;萬家余;丁壯;高宏偉;;朊病毒毒株多樣性及其生態(tài)學意義[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會第十二次學術研討會論文集[C];2007年

5 周祖華;張敏;程禮明;;瘋牛病發(fā)生、發(fā)展與防制對策[A];第二屆全國人畜共患病學術研討會論文集[C];2008年

6 宋有濤;;分子伴侶Hsp70家族對于朊病毒聚集的調控機制[A];2008年中國微生物學會學術年會論文摘要集[C];2008年

7 喬俊文;趙德明;楊建民;周向梅;尹曉敏;;綿羊朊病毒受體蛋白CDS區(qū)基因克隆與序列分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學會獸醫(yī)病理學分會第十五次、中國病理生理學會動物病生專業(yè)委員會第十四次學術討論會論文集[C];2007年

8 楊建民;趙德明;闞廣捍;李寧;郝永新;李瑩輝;吳斌;;實驗動物恒河猴朊病毒基因分析[A];中國實驗動物學會第六屆學術年會論文集[C];2004年

9 沈曼莉;李輝;何劍為;宋有濤;;鹵族鈉鹽對于酵母朊病毒[PSI+]聚集體形成的研究[A];泛環(huán)渤海地區(qū)九省市生物化學與分子生物學會——2011年學術交流會論文集[C];2011年

10 高躍;丁壯;高宏偉;;傳染性海綿狀腦病的致病機制及診斷方法研究進展[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會第十二次學術研討會論文集[C];2007年

相關重要報紙文章 前10條

1 本報記者 袁一雪;發(fā)現(xiàn)!病毒中有朊病毒[N];中國科學報;2019年

2 本報特約撰稿人 陸志城;朊病毒可引發(fā)手術隱患[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2003年

3 王有國;偶爾露崢蠑朊病毒自述[N];家庭醫(yī)生報;2006年

4 波訊;有助檢測異常朊病毒[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2001年

5 劉虹　本報記者 王春;新發(fā)現(xiàn)或將揭開“朊病毒”面紗[N];科技日報;2010年

6 蔣冰冰　記者 王春;科學家證明“朊病毒”導致“瘋牛病”假說[N];科技日報;2010年

7 胡德榮;我國科學家驗證28年前提出的“朊病毒”假說[N];中國醫(yī)藥報;2010年

8 記者 胡德榮;28年前提出的“朊病毒”假說獲證實[N];健康報;2010年

9 本報實習記者 楊璇;華東師范大學生命科學學院 袁崇剛 證明朊病毒導致瘋牛病假說[N];北京科技報;2010年

10 姜海;科學家找到瘋牛病致病新病毒[N];科技日報;2007年

相關博士學位論文 前8條

1 王超展;重組牛朊病毒和人粒細胞集落刺激因子的色譜復性并同時純化[D];西北大學;2004年

2 許尹;自噬系統(tǒng)在朊病毒感染過程中的變化規(guī)律及機制研究[D];中國疾病預防控制中心;2013年

3 王薈;PLKs介導神經(jīng)元細胞周期阻滯和朊病毒清除的機制研究[D];江蘇大學;2015年

4 李曉麗;二價金屬離子對PrP生物學活性的影響以及CytoPrP促進微管解聚導致細胞凋亡的研究[D];中國疾病預防控制中心;2010年

5 張易;sPMCA體系中輔助因子及相關物理條件對朊蛋白構象轉變的影響[D];華東師范大學;2015年

6 董辰方;PrP對tubulin和GFAP的影響及鏈霉素增加PrP~（Sc）檢測敏感性的研究[D];中國疾病預防控制中心;2008年

7 陳操;克—雅病患者腦脊液蛋白質組學分析及朊病毒感染中ADAM10變化的研究[D];中國疾病預防控制中心;2014年

8 楊再興;短多肽積聚機制的理論研究[D];浙江大學;2011年

相關碩士學位論文 前10條

1 魏順雄;朊病毒在小鼠和倉鼠之間傳播屏障的分子機制研究[D];華東師范大學;2019年

2 鐘正偉;利用藥物敏感型酵母篩選具有抗朊病毒活性的中藥提取物[D];遼寧大學;2011年

3 湯鑫;小鼠脾臟朊病毒復制重要相關因子的篩選與鑒定[D];吉林大學;2012年

4 劉宴村;中藥鉤藤和石斛對酵母朊病毒治愈效果的研究[D];遼寧大學;2015年

5 呂燕;補體系統(tǒng)在朊病毒感染動物腦組織中變化規(guī)律的研究[D];中國疾病預防控制中心;2015年

6 劉志培;miR-142-3p調控朊病毒致病作用的研究[D];天津大學;2012年

7 王莉潔;Cl~-/SO_4~(2-)的金屬鹽脅迫誘導酵母朊病毒[PSI~+]形成的研究[D];遼寧大學;2012年

8 白換力;姜黃素和阿魏酸抑制朊病毒復制作用的研究[D];吉林大學;2014年

9 紀洪芳;朊病毒正常功能與致病機理的計算化學研究[D];山東師范大學;2004年

10 王超展;重組牛朊病毒正常蛋白的分離純化及淫養(yǎng)藿中有效成分的提取、分離和結構鑒定[D];西北大學;2001年

本文編號：2779688