【摘要】：研究背景:骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)由Urist發(fā)現(xiàn)并命名,被認為是在肌肉等軟組織中誘導異位骨化的因子,隨后BMPs被證實也參與機體的多種器官組織的發(fā)育和形成,在機體中的多種細胞中發(fā)揮廣泛的生物作用。BMPs通過激活Smad依賴性通路和非Smad依賴性通路來影響基因表達。近年來關(guān)于不同物種、不同細胞、不同時間干預BMP信號通路的研究發(fā)現(xiàn)均可以導致骨量的不同變化,但具體機制尚不明了,且存在很大的爭議。目前的研究較多關(guān)注的是骨量的增多與減少,卻很少涉及骨的質(zhì)量問題。骨發(fā)生蛋白1A型受體-BMPR1A(也叫做Alk-3、Brk-1)與BMPs和BMPRII同屬于TGF-β(轉(zhuǎn)化生長因子β)家族,BMPR1A是BMP2,BMP4的強有力的受體,直接影響B(tài)MP2,BMP4在通路中的作用。BMP2是骨誘導因子,可以誘導間充質(zhì)細胞增生、分化為成骨細胞或軟骨細胞,在骨的發(fā)生、誘導、修復等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。BMP2可直接或間接參與破骨細胞的形成、分化、成熟及活性;BMP4是一個關(guān)鍵的成骨細胞因子,參與異位骨化的早期病變,對I型膠原蛋白(COL1)、堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(Ocn)的表達有刺激作用;BMP4可誘導間充質(zhì)干細胞分化形成軟骨細胞,并促進軟骨細胞的成熟。成骨細胞由骨髓間充質(zhì)干細胞分化而來,主要參與骨的形成和骨損傷的修復過程�；钴S的成骨細胞位于骨形成表面。分化成熟的成骨細胞合成并分泌胞外基質(zhì)蛋白,包括各種膠原和非膠原蛋白、形成類骨質(zhì)及啟動骨的形成。成年機體的骨形成,受到嚴格的調(diào)控以維持骨的穩(wěn)態(tài)。成骨細胞在骨形成過程中要經(jīng)歷成骨細胞增殖、細胞外基質(zhì)成熟、細胞外基質(zhì)礦化和成骨細胞凋亡幾個階段。很多因素可調(diào)節(jié)這幾個階段,從而最終調(diào)控骨形成。鑒于成骨細胞數(shù)量及功能在骨穩(wěn)態(tài)維持中的重要作用,以及BMPR1A介導的BMP信號通路在骨發(fā)育和骨形成中的重要影響,在本實驗中,我們擬觀察:1.觀察成骨細胞其可能的機制;2.觀測BMPR1A介導的BMP通路對成骨細胞終末分化的影響,小鼠骨礦化、膠原合成等能力的影響,是否導致小鼠骨質(zhì)量的變化,并探討其中可能的作用機制。實驗方法第一部分:成骨細胞中敲除bmpr1a在調(diào)控成骨細胞數(shù)量中的作用1.建立成骨細胞特異性敲除bmpr1a小鼠模型,并觀察小鼠大體形態(tài),測量體重和下肢骨長度;2.利用x線攝片、microct掃描、he染色等觀察小鼠骨量變化及骨組織結(jié)構(gòu)變化;3.trap染色觀察破骨細胞數(shù)量及功能,brdu免疫組織化學檢測成骨細胞增殖情況,tunel法觀察成骨細胞和生長板肥大層細胞凋亡情況,第二部分:成骨細胞中敲除bmpr1a對成骨細胞終末分化的調(diào)節(jié)作用1.對小鼠下肢骨標本進行半脫鈣處理,進行vonkossa礦化結(jié)節(jié)染色、masson染色、天狼星紅染色-偏振光顯微鏡等觀察礦化情況及膠原含量的變化,2.利用免疫組織化學染色檢測成骨細胞標志物osx、runx2、成骨礦化抑制因子opn、fgf23的表達;3.測定血清中堿性磷酸酶及鈣、磷含量,觀察小鼠鈣磷代謝是否正常;4.小鼠長骨原代成骨細胞及骨細胞體外分離培養(yǎng),并進行成骨誘導,茜素紅染色觀察礦化水平,流式細胞儀技術(shù)檢測細胞周期變化。提取細胞總rna,實時定量pcr檢測骨形成與骨吸收相關(guān)基因bmpr1a、β-catenin、rankl、opg的表達。5.對小鼠下肢骨標本,及牙齒組織標本進行處理后,掃描電鏡觀察細胞形態(tài)及骨量變化。實驗結(jié)果一、成骨細胞中敲除bmpr1a小鼠的松質(zhì)骨骨量增加明顯,主要由于成骨功能增強,破骨功能減弱導致。1.通過對比3.2cre與dmp1cre的表達位置我們可以明確3.2cre在成骨細胞中特異性表達,成骨細胞中敲除bmpr1a動物模型成立。2.成骨細胞中敲除bmpr1a(cko)小鼠與對照組相比外觀形態(tài)上無明顯差異,但其體型稍小,未見明顯的發(fā)育遲緩征象,但cko小鼠體重減輕,且下肢骨長度與對照小鼠對比有所縮短。3.bmpr1a敲除小鼠松質(zhì)骨骨量增加明顯。小鼠下肢骨的x線檢測發(fā)現(xiàn),cko小鼠長骨干骺端的放射密度較對照小鼠明顯增高。microct結(jié)果提示在橫截面上,小鼠脛骨從松質(zhì)骨至皮質(zhì)骨cko小鼠骨量均明顯增加,而脛骨組織切片的he染色可見,c KO小鼠的松質(zhì)骨骨量明顯增多,這與正常的長骨結(jié)構(gòu)差異顯著。4.cKO小鼠成骨細胞增殖及活性顯著增加。其成骨細胞標志RunX2、Osterix表達升高,BrdU檢測成骨細胞增殖活動加強,TUNEL凋亡檢測成骨細胞凋亡減弱,5.cKO小鼠破骨細胞活動減弱。cKO小鼠的骨組織中破骨細胞的數(shù)量減少,破骨細胞標志RANKL表達水平減弱,體外分離培養(yǎng)骨細胞中RANKL/OPG基因表達比值有所降低。二、成骨細胞中敲除BMPR1A小鼠成骨細胞終末分化受阻。1.在體與離體礦化染色實驗結(jié)果提示cKO小鼠骨組織礦化能力減弱,掃描電鏡結(jié)果提示c KO小鼠的骨細胞之間失去了正常細胞間的連接突觸,無細胞與細胞間的緊密聯(lián)系,骨皮質(zhì)變薄,且孔隙增多,失去了相互之間致密的連接。2.BMPR1A敲除小鼠骨膠原合成能力減弱,Masson染色發(fā)現(xiàn)cKO小鼠長骨的膠原成分含量與對照小鼠相比減弱明顯,從膠原成分分析,cKO小鼠長骨中所含膠原大多為III型膠原,I型膠原含量很少,而對照組小鼠則是Ⅰ型膠原為主,Ⅲ型膠原較少;從膠原的排列上來看,c KO小鼠的膠原排列與對照組相比顯得雜亂無章,失去了正常的縱向規(guī)律的排列。3.免疫組織化學染色結(jié)果提示c KO小鼠骨組織中骨礦化抑制因子OPN和FGF23的表達增強,血清中鈣水平與對照小鼠相比升高,而磷水平相對下降,c KO小鼠成骨細胞在細胞周期檢測中,有更多的細胞停留在了G期。結(jié)論一、成骨細胞中敲除BMPR1A后,小鼠的成骨細胞數(shù)量明顯增加,破骨細胞數(shù)量微量減少,小鼠骨量增加明顯。成骨細胞中BMPR1A信號通路對維持正常骨量有重要調(diào)控作用,可以通過調(diào)控成骨細胞數(shù)量以實現(xiàn)。二、成骨細胞中敲除BMPR1A后,小鼠的成骨細胞終末分化受阻,會導致成骨細胞礦化減少、膠原合成能力減弱、骨質(zhì)量下降,成骨細胞礦化能力的缺陷及骨基質(zhì)成分的表達減少可能造成了小鼠骨質(zhì)量下降和骨機械性能的破壞。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R329.2
【圖文】：

圖 1 成骨細胞中條件性敲除 BMPR1A 小鼠的建立2.1.2.2 基因型小鼠的鑒定(1)小鼠組織 DNA 基因提取與鑒定：1) 隨機編號小鼠（按每籠總只數(shù)），依據(jù)編號順序剪取小鼠足趾，放置于 1.5m中，EP 管同樣編號；2) 于裝有小鼠腳趾的 EP 管中加入 180μl 組織裂解液 A(0.025N NaOH, 2TA)，EP 管置于水浴鍋中，100℃水浴 1 小時，結(jié)束后將裝有腳趾的 EP 管迅速放箱-20°C 冷凍層冷卻 3-5 分鐘。3) 取出 EP 管，加入 180μl 中性緩沖液 B(40mM Tris 溶液)，使用移液槍進行反打，盡量使小鼠足趾組織溶解于裂解液中，震蕩混勻，所得溶液即含小鼠 DNA4) 4℃保存含有小鼠 DNA 的 EP 管。(2) PCR 鑒定基因型：引物序列如下所示：

果（A 圖 1、2 泳道為 ROSA26 基因條帶，3 泳道為 marker 基 1 泳道為 marker 基因條帶，2、3 泳道為 BMRP1A 基因雜合子條帶）

第三軍醫(yī)大學碩士學位論文 圖 1 電泳結(jié)果（A 圖 1、2 泳道為 ROSA26 基因條帶，3 泳道為 marker 基因條帶，4 泳道為Cre 基因條帶；B 圖 1 泳道為 marker 基因條帶，2、3 泳道為 BMRP1A 基因雜合子條帶，4 泳道為BMPR1A 基因純合子條帶）

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本文編號：2778811