【摘要】：壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis,NEC)是一常發(fā)生于新生兒,其是早產(chǎn)兒的消化道危重癥。早產(chǎn)是其發(fā)生的最主要危險(xiǎn)因素,其他原因包括:胃腸道喂養(yǎng)、腸道缺血、感染及炎性介質(zhì)失衡。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為NEC是在腸道異常病原菌定殖的情況下,腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)的應(yīng)用激發(fā)了早產(chǎn)極低出生體重兒尚不成熟的上皮細(xì)胞產(chǎn)生了過度的炎性反應(yīng)所致。在喂養(yǎng)相關(guān)致病因素中,腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物的選擇、何時(shí)開始腸道喂養(yǎng)、奶量增加速度都曾被研究,但目前只能確定母乳有預(yù)防NEC的作用,故多數(shù)機(jī)構(gòu)推薦對(duì)早產(chǎn)兒行母乳喂養(yǎng)。然而,僅30%極早產(chǎn)兒母親可分泌充分母乳。為滿足患兒營(yíng)養(yǎng)需求,多采用配方奶、母乳強(qiáng)化劑、牛(初)乳或母乳庫母乳進(jìn)行喂養(yǎng);以配方奶喂養(yǎng)最常見。然而,在臨床應(yīng)用中,許多研究者發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)兒配方奶可能是導(dǎo)致NEC發(fā)生的危險(xiǎn)因素。除了其缺乏母乳中特異性的免疫性腸道保護(hù)因子外,高滲透壓可能也與NEC的發(fā)生有關(guān)。高滲液體可引起腸道損傷早在20世紀(jì)70年代已有報(bào)道。當(dāng)高滲腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)作用于尚未發(fā)育成熟的腸組織,可能會(huì)造成腸粘膜損傷;而早產(chǎn)患兒腸上皮屏障還未發(fā)育完善,加上細(xì)胞防御或免疫功能不足,當(dāng)上皮屏障功能破壞后可能發(fā)生菌群移位,導(dǎo)致細(xì)胞介質(zhì)釋放和細(xì)胞因子激活,通過級(jí)聯(lián)性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致腸道損傷,甚至引發(fā)全身性炎癥反應(yīng)綜合征。然而,雖然已知人工喂養(yǎng)是早產(chǎn)兒發(fā)生NEC的重要危險(xiǎn)因需,為避免NEC發(fā)生而開奶時(shí)間過晚也并不可取。延遲腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)可能使胃腸道吸收功能減弱,導(dǎo)致后期喂養(yǎng)不耐受發(fā)生。這是因?yàn)榻巢荒芗せ钅c道激素分泌功能和腸道蠕動(dòng)能力,從而導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩和住院時(shí)間延長(zhǎng)。微量喂養(yǎng)、緩慢增加奶量是目前較常用的早產(chǎn)兒喂養(yǎng)方式;降低配方奶滲透壓,尤其是對(duì)存在NEC高危因素如感染、缺氧的早產(chǎn)兒,可能是減輕腸道損傷的一個(gè)有意義嘗試。在臨床工作中,我們已發(fā)現(xiàn)以稀釋配方奶喂養(yǎng)早產(chǎn)兒可減少NEC的發(fā)生率。另有其他研究發(fā)現(xiàn)以稀釋一倍的配方奶喂養(yǎng)早產(chǎn)或低出生體重兒可使其達(dá)到全胃腸道營(yíng)養(yǎng)的時(shí)間明顯縮短。目前,配方奶滲透壓可能造成腸道何種損傷、通過哪些途徑影響腸道功能尚無詳細(xì)報(bào)道;對(duì)于無法獲得母乳喂養(yǎng)的早產(chǎn)兒,尤其是有缺氧等病理基礎(chǔ)的患兒,降低配方奶滲透壓是否能減輕腸道損傷及炎癥反應(yīng)也無相關(guān)研究。為此,本研究應(yīng)用不同滲透壓奶液進(jìn)行人工喂養(yǎng),以缺氧復(fù)氧刺激+胃注脂多糖作為應(yīng)激刺激,比較滲透壓在應(yīng)激條件下對(duì)新生大鼠腸道形態(tài)學(xué)、腸上皮屏障、炎癥反應(yīng)方面的影響,為預(yù)防新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎,尤其是高危患兒提出新的治療思路。本研究分為以下六部分:研究?jī)?nèi)容一:建立新生大鼠NEC模型。將60只出生12小時(shí)內(nèi)Sprague Dawley(SD)大鼠平均隨機(jī)分為3組,分別為(1)鼠乳組,乳母鼠共處哺乳新生小鼠;(2)標(biāo)準(zhǔn)配方奶+缺氧+脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)組;(3)高滲配方奶+缺氧+LPS組。鼠乳滲透壓377mOsm/kg;標(biāo)準(zhǔn)配方奶按廠家說明配制,滲透壓256mOsm/kg;高滲配方奶增加奶粉濃度至滲透壓為512mOsm/kg。低氧通過自制密閉養(yǎng)殖箱,充入純氮?dú)饩S持氧濃度5%。LPS按4mg/kg/d經(jīng)胃灌入。造模時(shí)間48小時(shí)。此時(shí)觀察到實(shí)驗(yàn)組大鼠出現(xiàn)體重增長(zhǎng)緩慢、活動(dòng)減少、對(duì)刺激反應(yīng)減慢,部分出現(xiàn)皮膚發(fā)青、胃潴留等。處死大鼠解剖腸道,可見實(shí)驗(yàn)組回腸存在腸管擴(kuò)張、彈性差、腸壁淤血及腸壁積氣現(xiàn)象;結(jié)腸主要表現(xiàn)為腸壁積氣。HE染色可見實(shí)驗(yàn)組末端回腸絨毛脫落、絨毛縮短、固有層與肌層分離、腸壁淤血等NEC樣改變,部分可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)。證明人工喂養(yǎng)+缺氧+LPS誘導(dǎo)48小時(shí)新生大鼠的NEC模型建立成功。研究?jī)?nèi)容二:為觀察降低配方奶滲透壓是否可減輕對(duì)腸上皮的損傷,我們?cè)O(shè)立低滲配方奶+缺氧+LPS組,以稀釋配方奶(滲透壓128mOsm/kg)喂養(yǎng)大鼠。采用HE染色觀察大鼠腸上皮組織學(xué)形態(tài),并與鼠乳組、標(biāo)準(zhǔn)組、高滲組進(jìn)行比較。同時(shí)通過透射電鏡觀察各組在超微水平下的絨毛形態(tài)、細(xì)胞器、緊密連接蛋白的特點(diǎn)。結(jié)果顯示,生后48小時(shí)時(shí),與標(biāo)準(zhǔn)組及高滲組相比,低滲組大鼠一般情況及腸道大體病理變化較輕,上皮絨毛長(zhǎng)度較長(zhǎng),腸上皮病理損傷程度降低;電鏡下見腸上皮細(xì)胞微絨毛損傷程度較輕、緊密連接長(zhǎng)度較短。說明低滲喂養(yǎng)能減輕大鼠回腸上皮組織學(xué)損傷。研究?jī)?nèi)容三:使用免疫熒光(immunofluorescence,IF)、熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot,WB)方法檢測(cè)新生大鼠NEC模型中閉鎖小帶蛋白-1(zonula occluden-1,ZO-1)、閉合蛋白(Occludin)表達(dá)情況。IF及WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大鼠回腸中ZO-1、Occludin在蛋白水平表現(xiàn)為鼠乳組低滲組標(biāo)準(zhǔn)組高滲組。ZO-1的mRNA表達(dá)水平為鼠乳低滲/標(biāo)準(zhǔn)高滲,其中低滲組和標(biāo)準(zhǔn)組無差異;Occludin的mRNA水平為鼠乳低滲標(biāo)準(zhǔn)高滲。此結(jié)果說明低滲可減輕NEC時(shí)腸道緊密連接蛋白的破壞,從而保護(hù)腸道屏障功能。研究?jī)?nèi)容四:使用免疫組化(immunohistochemical,IHC)、RT-qPCR方法檢測(cè)新生大鼠NEC模型中粘液蛋白2(mucin2,MUC2)表達(dá),結(jié)果顯示其mRNA水平為低滲組標(biāo)準(zhǔn)組高滲組鼠乳組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。而通過軟件分析IHC切片發(fā)現(xiàn)在蛋白水平鼠乳組低滲組標(biāo)準(zhǔn)組高滲組。這提示實(shí)驗(yàn)條件下低滲組MUC2蛋白表達(dá)高于標(biāo)準(zhǔn)、高滲組,可能與其mRNA轉(zhuǎn)錄水平活躍有關(guān)。研究?jī)?nèi)容五:為研究低滲通過何種機(jī)制減輕腸上皮損傷,我們檢測(cè)不同處理組核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor kappa B,NF-κB)情況。我們用WB分析NF-κB p65蛋白表達(dá)水平,利用免疫熒光檢測(cè)NF-κB p65在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及分布。WB結(jié)果顯示,低滲組NF-κB p65蛋白表達(dá)與鼠乳組無明顯差別,而低滲組標(biāo)準(zhǔn)組高滲組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明低滲喂養(yǎng)可能通過減輕腸上皮細(xì)胞的NF-κB p65的激活起到保護(hù)作用。研究?jī)?nèi)容六:以45例手術(shù)治療病例(手術(shù)組)及43例保守治療好轉(zhuǎn)病例(保守組)為研究對(duì)象,兩組患兒發(fā)病前(T0)、NEC起病時(shí)(T_1)、手術(shù)組手術(shù)前(T_2)(保守組發(fā)病后36h)的白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood cell count,WBC)、血小板計(jì)數(shù)(platelet count,PLT)及C反應(yīng)蛋白水平(C-reactive protein,CRP)分別記為WBC_0、PLT_0、CRP_0、WBC_1、PLT_1、CRP_1及WBC_2、PLT_2、CRP_2。對(duì)各變量進(jìn)行Manner-Whitney U檢驗(yàn),其中存在差異變量采用Logistic回歸及受試者工作特性曲線(receiver operating curve,ROC)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組間WBC_2、PLT_2、CRP_2差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。通過回歸分析發(fā)現(xiàn)WBC_2和PLT_2是手術(shù)的獨(dú)立因素,回歸方程為ln(P/(1-P))=2.725-0.191WBC_2-0.007PLT_2,其中P代表預(yù)測(cè)手術(shù)概率(predictive probability,P)。ROC分析用由WBC_2和PLT_2構(gòu)成的回歸方程預(yù)測(cè)手術(shù)的曲線下面積可達(dá)到83%,預(yù)測(cè)概率P的最佳診斷界值為0.55,此時(shí)敏感性83%,特異性81%。此預(yù)測(cè)概率P在驗(yàn)證組中敏感性和特異性分別84%和86%�？傊�,本研究證實(shí)了我們的實(shí)驗(yàn)設(shè)想,低滲配方奶可減輕人工喂養(yǎng)+缺氧復(fù)氧刺激+LPS聯(lián)合刺激下新生大鼠的腸道損傷,并對(duì)其可能的機(jī)制進(jìn)行了初步探討,這為探尋臨床NEC高�；純旱哪c道喂養(yǎng)方式提供了理論依據(jù)。另外,通過臨床數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)了血常規(guī)指標(biāo)的聯(lián)合應(yīng)用可判斷未穿孔NEC患兒是否需要手術(shù)。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R-332;R726.5
【圖文】：

腸上皮損傷的作用及血常規(guī)對(duì)未穿孔NEC手術(shù)指征的預(yù)測(cè)- 15 -圖1 造模結(jié)束后鼠乳組、標(biāo)準(zhǔn)組、高滲組大鼠外觀。A、D：鼠乳組，外觀正常，活動(dòng)自如，皮下脂肪豐滿；B、E：標(biāo)準(zhǔn)組，皮膚發(fā)青，活動(dòng)力下降，皮下脂肪��；C、F：高滲組，皮膚發(fā)青，活動(dòng)力下降，皮下脂肪薄，部分大鼠胃內(nèi)可見奶液潴留。（二）人工喂養(yǎng)+缺氧+LPS處理NEC模型建立效果1、大體病理鼠乳組大鼠空腸為乳白色，回腸呈淡黃色，彈性好，無積氣、積液出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)組部分大鼠出現(xiàn)腸管擴(kuò)張、腸壁淤血或腸壁積氣；損傷以結(jié)腸最重，回腸次之，而空腸損傷較輕。通過解剖發(fā)現(xiàn)，腸道大體形態(tài)改變符合NEC表現(xiàn)（圖2）。根據(jù)Zani[25]對(duì)大鼠腸道大體病理評(píng)分

圖2.各組大鼠腸道大體形態(tài)。A：鼠乳組，腸道形態(tài)正常；B：等滲組，回腸擴(kuò)張、性差，腸壁積氣；C：高滲組，末端回腸及結(jié)腸腸管廣泛擴(kuò)張、積氣；D：標(biāo)準(zhǔn)組腸腔內(nèi)可見氣泡；E：高滲組，腸壁明顯積氣，腸壁變薄。（↑為腸壁積氣）2、組織學(xué)改變鼠乳組大鼠回腸結(jié)構(gòu)完整，腸黏膜完整連續(xù)，腺體排列規(guī)則，分泌功能活躍。絨毛多而細(xì)長(zhǎng)，呈指狀或葉狀向腸腔內(nèi)突入，絨毛表面由單層柱狀上皮細(xì)胞覆蓋，皮結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，胞核深染，隱窩豐富；未見充血水腫、分離斷裂等，分可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)為腸壁變薄，絨毛縮短增寬，可見絨毛壞死脫落致絨毛參差不齊；隱窩數(shù)量減少、結(jié)構(gòu)紊亂，部分隱窩裸露；固有層與肌層分離；分腸壁可見出血。上皮細(xì)胞腫脹，呈空泡樣，胞漿淡染，絨毛頂端的上皮細(xì)胞變平/或脫屑，可見細(xì)胞核固縮。各組大鼠腸道組織學(xué)形態(tài)見圖3。

腸上皮損傷的作用及血常規(guī)對(duì)未穿孔NEC手術(shù)指征的預(yù)測(cè)- 17 -圖3. 各組大鼠的腸道組織HE染色結(jié)果（A~C：100×；D~F：200×）A、D：鼠乳組，絨毛細(xì)長(zhǎng)，排列規(guī)則，上皮細(xì)胞呈柱狀；B、E：標(biāo)準(zhǔn)組，絨毛縮短、脫落；C、F：高滲組，絨毛參差不齊，可見固有層與肌層分離（↑）。每組各選取3張HE染色切片，光鏡調(diào)至10×10倍，測(cè)量視野中絨毛高度，取其平均值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果為：絨毛高度（單位um）：對(duì)照組178±5.8

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1 余夢(mèng)楠;低滲腸內(nèi)喂養(yǎng)對(duì)減輕大鼠NEC模型腸上皮損傷的作用及血常規(guī)對(duì)未穿孔NEC手術(shù)指征的預(yù)測(cè)[D];中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2775556