【摘要】：金黃色葡萄球菌是一種常見的革蘭氏陽性致病菌。該菌廣泛地存在于環(huán)境中,可寄生各類宿主。金黃色葡萄球菌寄生在人體后,會造成一系列的疾病,小到皮膚、軟組織感染,大至危害性命的疾病,例如肺炎、骨髓炎、敗血癥和感染性心肌炎等。目前臨床上多用抗生素來治療金黃色葡萄球菌感染,但伴隨抗生素的長期使用,臨床上已進(jìn)化出抗甲氧西林金黃色葡萄球菌和抗萬古霉素金黃色葡萄球菌等多重耐藥菌屬,極大的提高了金葡菌感染的臨床治療難度和治愈周期,對公共衛(wèi)生帶來沉重壓力。尋找新的金葡菌感染治療靶點和治療方法已刻不容緩。金黃色葡萄球菌的致病性主要與體內(nèi)大量的毒力因子表達(dá)、釋放有關(guān),各類毒力因子幫助金黃色葡萄球菌接近并粘附至宿主表面,進(jìn)而侵染宿主細(xì)胞。這些毒力因子的表達(dá)由多種效應(yīng)因子調(diào)控,雙組份調(diào)控系統(tǒng)是其中非常重要的一類調(diào)控因子。雙組份調(diào)控系統(tǒng)被認(rèn)為是細(xì)菌、低等真核生物以及植物中感應(yīng)環(huán)境變化并做出相應(yīng)應(yīng)答的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方式。該系統(tǒng)一般由一個具有信號感應(yīng)能力的組氨酸激酶和一個下游的效應(yīng)調(diào)節(jié)因子組成。該系統(tǒng)的運作模式大致為組氨酸激酶接受環(huán)境變化刺激信號后,在保守的組氨酸位點發(fā)生自磷酸化,接著再將磷酸化基團(tuán)傳遞給下游的效應(yīng)調(diào)節(jié)因子,從而改變效應(yīng)調(diào)節(jié)因子對特定DNA底物的結(jié)合親和力,最終改變特定基因的轉(zhuǎn)錄水平。在金黃色葡萄球菌中,由于雙組份調(diào)控系統(tǒng)直接參與控制金葡菌的各類關(guān)鍵生命活動,因此被視為非常有潛力的新型治療靶點。ArlR/S是金葡菌雙組份調(diào)控系統(tǒng)中的一員,其中ArlS為具有信號感應(yīng)能力的組氨酸激酶,ArlR是其對應(yīng)的效應(yīng)調(diào)控因子。目前已有的體內(nèi)實驗研究證明該雙組份調(diào)控系統(tǒng)可以在多種生理過程中發(fā)揮作用,包括影響調(diào)控分子RNAⅡ、RNAⅢ和自溶素的生成,以及抑制金葡菌的生物被膜形成等等。在這些生理功能中,ArlR蛋白對全局調(diào)控因子agr的識別機(jī)制及調(diào)控機(jī)理受到廣泛關(guān)注,但是由于已有研究僅停留在細(xì)胞生物學(xué)水平上,其分子機(jī)制至今尚不清楚。針對上述科學(xué)問題,在本論文的第一部分中,我們就金葡菌ArlR蛋白與全局調(diào)控因子agr的識別及調(diào)控機(jī)制展開了研究。通過體外重組表達(dá),我們分別獲得了全長的ArlR蛋白,只含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的ArlRDBD蛋白以及模擬磷酸化修飾狀態(tài)的全長ArlRD52E蛋白。通過EMSA方法研究了 ArlR蛋白及其突變體與agr基因間的相互作用情況,發(fā)現(xiàn)ArlRDBD和ArlRD52E可結(jié)合agr,而ArlR蛋白只有當(dāng)濃度相當(dāng)高的時候才可以結(jié)合agr。通過DNaseI酶解足跡法我們找到了ArlR可以特異性識別的兩個agr區(qū)段,其長度分別為21 bp和31 bp;通過FPA方法,我們測定了三種蛋白樣品與這兩個特異性識別區(qū)段間各自的相互作用參數(shù)。采用分子排阻層析、動態(tài)光散射和化學(xué)交聯(lián)三種方法,我們發(fā)現(xiàn)在溶液中,ArlR蛋白的聚集狀態(tài)為單體,磷酸化后的ArlRD52E蛋白為二聚體,ArlRDBD蛋白主要為單體。為了闡明上述聚集狀態(tài)變化與DNA結(jié)合能力變化之間的關(guān)系,我們解析獲得了 2.5 A分辨率的ArlRDBD蛋白晶體結(jié)構(gòu)。通過對該結(jié)構(gòu)的比對分析和一系列突變體實驗,我們確認(rèn)了 ArlRDBD蛋白的DNA結(jié)合位點及其對DNA底物的長度偏好性。綜合上述結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物化學(xué)實驗結(jié)果,我們提出了一種ArlR蛋白調(diào)控全局調(diào)控因子agr的可能機(jī)制。該工作對深入理解雙組分系統(tǒng)中磷酸化修飾對蛋白的DNA結(jié)合親和力調(diào)節(jié)機(jī)理具有重要的促進(jìn)作用。嘧啶二聚體是DNA在太陽光紫外輻射下產(chǎn)生的一種常見的DNA損傷形式。紫外光可以誘導(dǎo)核酸鏈在相鄰堿基的C=C雙鍵附近形成共價連接。在陽光照射下,單個人類皮膚細(xì)胞每秒會發(fā)生50-100次上述損傷反應(yīng),部分未被及時修復(fù)的嘧啶二聚體會抑制DNA聚合酶的功能,進(jìn)而影響基因的轉(zhuǎn)錄或者復(fù)制,引致突變、染色體異常和細(xì)胞凋亡等現(xiàn)象,同時還可能引發(fā)黑色素瘤的生成。為了應(yīng)對紫外輻射所造成的損傷,生物體進(jìn)化出了多種修復(fù)機(jī)制。光修復(fù)系統(tǒng)就是其中一種重要的DNA損傷修復(fù)途徑。在低等生物中,光修復(fù)酶/隱花色素家族蛋白負(fù)責(zé)行使上述修復(fù)功能。該家族蛋白均為光受體蛋白,可以通過吸收光能,推動電子在FADH-和損傷位點之間的傳遞,并將嘧啶二聚體還原成正常堿基。光修復(fù)酶中通常會結(jié)合兩個輔因子,分別為催化基團(tuán)FAD和負(fù)責(zé)吸收光的發(fā)色基團(tuán)。在本論文的第二部分中,我們通過基因數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)鈍節(jié)螺旋藻中的一個基因(基因編號NIES39_D05560)可能編碼了一種光修復(fù)酶,通過對該基因的重組表達(dá)和酶活檢測,確認(rèn)該基因編碼的Ap-phr蛋白可修復(fù)單鏈和雙鏈DNA中的嘧啶二聚體,并歸屬于CRY-DASH光修復(fù)酶亞家族。通過解析Ap-phr蛋白1.6 A分辨率晶體結(jié)構(gòu),我們發(fā)現(xiàn)該蛋白除催化輔因子FAD以外,還具有吸光發(fā)色團(tuán)MTHF,且相較于同源光修復(fù)酶蛋白結(jié)構(gòu),Ap-phr蛋白中的MTHF結(jié)合位置及構(gòu)象均存在顯著差異。上述差異可能會增強(qiáng)Ap-phr蛋白中MTHF到FAD的能量傳遞速率,有可能是CRY-DASH光修復(fù)酶亞家族蛋白在弱光條件下依然能收集積蓄光能的重要原因之一。
【圖文】：

更好地應(yīng)對環(huán)境的改變。逡逑盡管雙組份調(diào)控系統(tǒng)在一些例如酵母、絲狀真菌、低等致病菌和低等植存在，但在一些高等的真菌中卻沒有發(fā)現(xiàn)，包括人類中也沒有發(fā)現(xiàn)相類系統(tǒng)。因此基于對ＴＣＳｓ的特性的充分掌握，它們己經(jīng)被視為一個很有療靶點來治療由一些致病微生物造成的疾�。保保梗荨ｅ义希龋送ǔ：袃蓚�保守的結(jié)構(gòu)域，包含保守組氨酸位點（發(fā)磷酸化團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)的位點）的二聚化組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域（ＤＨｐ）和具有催的ＡＴＰ結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ＣＡ）。此外，組氨酸激酶在ＤＨｐ的Ｎ末端還含有多個結(jié)構(gòu)域。對于大多數(shù)的激酶來說在Ｎ端含有】－１３個不等的跨膜結(jié)而信號識別則主要發(fā)生在胞質(zhì)側(cè)或者蛋白的胞外段。盡管ＨＫ含有一些構(gòu)域，但是胞外的信號識別結(jié)構(gòu)域卻相對比較多變。對于許多ＨＫ來說，，結(jié)構(gòu)域和ＤＨｐ結(jié)構(gòu)域之間還含有至少一個結(jié)構(gòu)域，目前比較多見的是Ｐ合血紅素或者黃素的結(jié)構(gòu)域），ＨＡＭＰ邋（作為ｌｉｎｋｅｒ的結(jié)構(gòu)域）和ＧＡＦ邋ｃＧＭＰ的結(jié)構(gòu)域）結(jié)構(gòu)域這些結(jié)構(gòu)域可以負(fù)責(zé)從胞外信號識別結(jié)構(gòu)傳遞給ＤＨｐ和ＣＡ結(jié)構(gòu)域，或者有一些甚至可以直接識別胞質(zhì)段的信號［２｜ｓｉｇｎａｌ邋＇逡逑

在目前己經(jīng)解析的ＲＲ結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)ＲＲ的結(jié)構(gòu)比較保守。Ｎ端的ＲＤ通常為（３卜逡逑ａｌ－Ｐ２－ａ２－ｐ３－ａ３－ｐ４－ａ４－ｐ５－ｃｔ５的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，并且有一個保守的磷酸化位點在其中逡逑１２３１。ａ４－邋ｐ５－ａ５界面中更是有許多在家族中高度保守的氨基酸殘基，實驗也證明逡逑了這三個結(jié)構(gòu)元素對于ＲＲ發(fā)揮功能是不可或缺的［２４】。ＤＢＤ通�？山Y(jié)合特定的逡逑串聯(lián)或者反向重復(fù)序列來啟動調(diào)控的功能１１２］。連接ＲＤ和ＤＢＤ的丨ｉｎｋｅｒ區(qū)的長逡逑度也通常有所差異，這種差異可能直接與兩個結(jié)構(gòu)域的取向相關(guān)［２５】。逡逑有將近５０％的ＲＲｓ只含有一個ＤＮＡ結(jié)合結(jié)構(gòu)域作為效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，但發(fā)現(xiàn)在發(fā)逡逑揮功能時ＲＲ經(jīng)常以二聚體的形式出現(xiàn)，因此認(rèn)為二聚的出現(xiàn)對于ＲＲ開始發(fā)揮逡逑功能起著重要的作用。二聚體的出現(xiàn)也使ＲＲ在發(fā)揮作用時存在多個作用面，包逡逑括ＲＤ之間的結(jié)合面和ＲＤ與ＤＢＤ之間的結(jié)合面。在許多ＲＲ轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)現(xiàn)逡逑磷酸化介導(dǎo)了邋ＲＤ二聚體結(jié)合面的形成，同時也發(fā)現(xiàn)了四種ＲＤ二聚的模式（見逡逑圖１．３）邋［２６］。此外，在對ＫｄｐＥ因子的研究中發(fā)現(xiàn)，突變ＲＤ和ＤＢＤ界面中相互逡逑作用的氨基酸殘基破壞作用界面會導(dǎo)致蛋白功能的喪失，這直接證明了邋ＲＤ和逡逑ＤＢＤ之間作用面的重要性［２７］。除了結(jié)合ＤＮＡ的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，ＲＲ的信號輸出結(jié)逡逑構(gòu)域還可能是甲基轉(zhuǎn)移酶或者雙鳥苷酸環(huán)化酶。逡逑
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R378

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