【摘要】：在細(xì)胞膜上形成不同類型的孔,可導(dǎo)致不同類型的細(xì)胞死亡,其深刻地影響細(xì)胞的命運(yùn)和疾病狀態(tài)。細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞可通過分泌穿孔素在細(xì)胞膜上成孔來介導(dǎo)病毒感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞死亡。脂多糖等細(xì)菌毒素可誘導(dǎo)GSDMD發(fā)生剪切,在細(xì)胞膜上成孔來誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡。發(fā)生焦亡的細(xì)胞會(huì)釋放大量炎性內(nèi)容物,引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),過度的細(xì)胞焦亡可導(dǎo)致各種免疫性疾病甚至發(fā)生感染性休克。然而,迄今為止,這些細(xì)胞膜上的孔的結(jié)構(gòu)和形態(tài)從未真正被觀察到。最近研究表明,原子力顯微鏡(atomic force microscope,AFM)是分析生物分子和細(xì)胞結(jié)構(gòu)性質(zhì)的有力工具。AFM可達(dá)到原子分辨率的水平來觀察生物樣品的表面粗糙度。因此我們使用AFM來清晰地顯示不同原因造成的細(xì)胞膜孔結(jié)構(gòu)。我們使用293T細(xì)胞進(jìn)行真核重組表達(dá)人PFR,并將其用于處理OVA-B16黑色素腫瘤細(xì)胞。處理15分鐘后,為了方便觀察,使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞,并通過AFM掃描成像進(jìn)行觀察,在OVA-B16黑色素腫瘤細(xì)胞膜表面發(fā)現(xiàn)了形成的孔洞。應(yīng)用細(xì)菌來源的一種毒素,鏈球菌溶血素O來處理OVA-B16黑色素腫瘤細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)了清晰的孔洞,但AFM成像顯示PFR在細(xì)胞膜上成孔的直徑明顯比鏈球菌溶血素O大。此外我們使用AFM成像發(fā)現(xiàn),細(xì)胞膜表面的孔洞形成具有時(shí)間依賴性,細(xì)胞膜表面隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),孔洞的數(shù)量直徑也在相應(yīng)增加。使用AFM進(jìn)一步觀察到細(xì)胞通過某種方式自我修復(fù)了由鏈球菌溶血素O在細(xì)胞膜上形成的孔洞。人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞系中和人乳腺癌MC7-F細(xì)胞系中過表達(dá)焦亡的執(zhí)行分子GSDMD,通過AFM觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜上均有孔洞的形成。有研究表明補(bǔ)體通過在細(xì)胞膜上成孔來殺滅病原菌,在本研究中,AFM成像為補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞膜表面成孔提供了有力的可視化證據(jù)。AFM這種可視化不僅清晰的顯示了不同因素形成的細(xì)胞膜孔洞的孔徑和深度的區(qū)別,而且發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞膜孔洞的形成具有時(shí)間依賴性。AFM這種類型的可視化生動(dòng)地揭示了細(xì)胞膜孔形成,融合和修復(fù)的動(dòng)態(tài)過程,為之后對(duì)細(xì)胞成孔的研究提供了有力的支持。
【圖文】：

圖１使用ＡＦＭ觀察ＳＬＯ邋／ＰＦＲ誘導(dǎo)的孔形成。（ａ）分別用ＰＢＳ或ＰＦＲ邋（５０Ｕ）ＯＶＡ－Ｂ１６細(xì)胞系１５ｍｉｎ，然后用ＰＢＳ洗滌細(xì)胞兩次之后在原子力顯微鏡下成像觀察。ｂ－ｇ首先分別用分離自活化的人ＣＤｒＴ細(xì)胞的ＳＬＯ或ＰＦＲ邋（５０Ｕ）ＯＶＡ－Ｂ１６細(xì)胞系（１Ｘ１０５）邋５分鐘，并用４％多聚甲醛固定，用ＡＦＭ成像。（胞系被固定后，在ＡＦＭ下成像。（ｃ）細(xì)胞膜的３Ｄ拓?fù)鋱D（ｄ）基于高分辨率

我們研究了邋ＳＬＯ誘導(dǎo)孔洞形成的動(dòng)態(tài)過程。用濃度５０Ｕ的ＳＬＯ處理逡逑ＯＶＡ－Ｂ１６黑色素腫瘤細(xì)胞１０分鐘或３０分鐘時(shí)，孔洞開始形成，并且孔洞的數(shù)目逡逑X椉櫻ㄍ跡玻幔�，随着处理时紲Z難映�，细胞膜钡a嬉蒼嚼叢醬植冢ㄍ跡玻猓�，这表辶x廈骺錐吹男緯曬淌薔哂惺奔湟覽敵�。此外＿b幔遙窈停遙恚幔鬧迪嚶Φ卦黽櫻ㄍ煎義希玻悖�。处理时紲Z難映げ喚鍪瓜赴ど峽錐吹氖吭黽櫻赴ど匣鉤魷至撕芏嘀卞義暇督洗蟮目錐矗ㄍ跡玻洌澹�。芯暽较大的垮F純贍芄橐蠐諦】椎娜諍�，并沁b櫻蹋峽贍蓯瑰義嫌媚持趾愣Ｊ皆諳赴ぶ諧中緯煽�。晤U怯茫擔(dān)埃斟澹櫻蹋洗恚希鄭粒攏保逗諫刂族義狹魷赴氖奔潿文�，并将将ＰＩ加入上清液中，通过ＰＩ进入细胞的扰f懇越徊藉義現(xiàn)な悼錐蔥緯墑且桓鍪奔湟覽敵怨獺Ｎ頤塹難芯拷峁⑾鄭校墑賈找允奔湟覽檔膩義戲絞澆耄希鄭粒攏保逗諫刂琢魷赴�。烟Ｏ加入４贩N又螅校煽梢越胂赴繡義先舊�。烟Ｏ加入１０贩N又螅�，蠟�(zāi)黽恿訟赴校校扇舊那慷齲す夤簿勱瓜暈㈠義暇檔慕峁土魘較赴塹慕峁捕賈っ髁爍媒峁ㄍ跡玻

本文編號(hào)：2679555