【摘要】：目的:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備抗腸道病毒71型雞卵黃抗體(anti-EV71 IgY),開(kāi)展其在體內(nèi)及體外抗腸道病毒71型(EV71),體外抗柯薩奇病毒A16型(CVA16)的相關(guān)檢測(cè),并對(duì)其抗EV71和CVA16的作用機(jī)制進(jìn)行探討。以期探索出一種新的能交叉被動(dòng)免疫治療由EV71和CVA16引發(fā)的手足口病(HFMD)方案。方法:以EV71毒株作為抗原,與弗氏不完全佐劑1:1混合并吹打使其乳化均勻,通過(guò)多次注射來(lái)免疫SPF級(jí)母雞,收集并提取純化IgY;蛋白定量法檢測(cè)IgY的總蛋白濃度;通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測(cè)試IgY純度;采用間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)來(lái)評(píng)價(jià)特異性IgY的濃度變化規(guī)律;蛋白質(zhì)印記法和免疫雙向瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)純化IgY的特異性;采用觀測(cè)人橫紋肌肉瘤細(xì)胞(RD)的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)檢測(cè)特異性IgY體外對(duì)EV71與CVA16中和能力的量效關(guān)系,抗EV71穩(wěn)定性和時(shí)效性;通過(guò)免疫熒光法檢測(cè)特異性IgY在非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)中的抗EV71作用;灌胃給藥檢測(cè)特異性IgY對(duì)被EV71病毒感染的新生BALB/c鼠的保護(hù)作用。結(jié)果:IgY總蛋白濃度在免疫后整體呈上升趨勢(shì);SDS-PAGE電泳圖顯示純化的IgY純度良好,可被分裂為分子量約為70 kDa的IgY重鏈(H)及30 kDa的IgY輕鏈(L);通過(guò)ELISA我們發(fā)現(xiàn)特異性IgY濃度在免疫后的第7天出現(xiàn)增加,在第7周達(dá)到最高,并在較高水平維持4周左右;免疫雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)與Western blot測(cè)得特異性IgY具有與EV71、CVA16毒株良好的免疫結(jié)合性,能特異性識(shí)別EV71和CVA16的包膜蛋白VP1及VP3;IgY體外中和病毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,特異性IgY能抑制EV71病毒和CVA16病毒的感染病變能力,并呈劑量-效應(yīng)相關(guān)關(guān)系,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;特異性IgY在感染早期對(duì)EV71病毒有很強(qiáng)的抑制作用,感染后期抑制效果不明顯;特異性IgY在4℃、室溫、37℃條件下48 h后抗病毒活性依然穩(wěn)定,60℃條件下1.6μg/mL仍能對(duì)病毒達(dá)到100%的抑制率。反復(fù)凍融5次后對(duì)IgY的抗病毒活性沒(méi)有影響。特異性IgY對(duì)腸道病毒EV71、CVA16有很強(qiáng)的抑制活性,對(duì)其他腸道病毒抑制效果不明顯;免疫熒光法顯示特異性IgY在3.72μg/mL對(duì)Vero細(xì)胞中的毒株能達(dá)到近乎100%的抑制作用;特異性IgY實(shí)驗(yàn)組新生鼠生存率達(dá)到100%,相比于對(duì)照組無(wú)消瘦,精神萎靡,毛發(fā)生長(zhǎng)異常等癥狀。結(jié)論:(1)免疫后提取的特異性IgY純度與抗病毒特異性良好。(2)特異性IgY能識(shí)別EV71、CVA16病毒的包膜蛋白VP1與VP3,在體外抗病毒實(shí)驗(yàn)中能有效地抑制EV71病毒和CVA16病毒活性并呈劑量-效應(yīng)相關(guān)關(guān)系。(3)特異性IgY作用于EV71感染早期處理明顯優(yōu)于后期,并且特異性IgY的穩(wěn)定性較好。(4)特異性IgY灌胃給藥后可以對(duì)被EV71攻擊的乳鼠提供保護(hù)。
【圖文】：

24圖2 初次免疫后特異性IgY的變化規(guī)律Figure 2. The development pattern of specific IgY after primary immunization2.4 免疫雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)根據(jù)免疫雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，初次免疫后第 7 周卵黃抗體的特異性如圖 A 和 B，中心 EV71 與 CVA16 毒株抗原孔與周?chē)?1:2、1:4 和 1:8 稀釋的特異性 IgY 抗體孔之間出現(xiàn)了明顯的白色免疫沉淀線，而陰性對(duì)照 PBS孔與抗原孔之間沒(méi)有出現(xiàn)免疫沉淀線，表明制備的特異性 IgY 具有與 EV71和 CVA16 毒株特異結(jié)合的能力。

25圖3 免疫雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，特異性IgY對(duì)EV71毒株和CVA16毒株的免疫結(jié)合性分析。(A) EV71的雙向免疫瓊脂擴(kuò)散；(B) CVA16的雙向免疫瓊脂擴(kuò)散。Figure 3. Agar Double Immunodiffusion， characterization of the specific IgY against EV71 strain andCVA16 strain. (A) Bidirectional immune agar diffusion test for EV71. (B) Bidirectional immune agardiffusion test for CVA16.2.5 Western blot 蛋白檢測(cè)純化 IgY 特異性WB 結(jié)果顯示特異性 IgY 抗體在圖 A 和 B 的 1、2 泳道能特異性識(shí)別EV71 和 CVA16 病毒的 VP1（36 kDa）與 VP3（28 kDa）[51, 52]蛋白，產(chǎn)生良好的免疫結(jié)合反應(yīng)。而對(duì)照組 IgY 不能識(shí)別兩種病毒的包膜蛋白（5、6泳道），提示對(duì)照組 IgY 不具有與病毒的免疫反應(yīng)性。用商品化 VP1 單克隆抗體對(duì) EV71 和 CVA16 抗原的 VP1 蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖 A 和 B 的第 5、6 泳道所示，，驗(yàn)證了電泳后 VP1 蛋白分子量。用商品化 VP1 蛋白對(duì)制備的IgY 進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖 C
【學(xué)位授予單位】：桂林醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R392-33

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7 周廣森;王學(xué)玲;;IBD康復(fù)雞卵黃抗體防治IBD試驗(yàn)[J];中國(guó)畜禽傳染病;1993年01期

8 張紹蘭;;雞卵黃抗體研究進(jìn)展[J];西南軍醫(yī);2008年03期

9 謝獻(xiàn)勝,周新民,王鋒;免疫雞卵黃抗體研究進(jìn)展[J];中國(guó)家禽;2005年10期

10 劉博婷;朱必鳳;;雞卵黃抗體的研究與應(yīng)用[J];韶關(guān)學(xué)院學(xué)報(bào);2007年09期

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8 王成祖;張瑾;劉池波;劉文琪;;抗日本血吸蟲(chóng)SEA雞卵黃抗體的制備與鑒定及其初步應(yīng)用[A];第二屆中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)暨細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)改革會(huì)議論文集[C];2008年

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本文編號(hào)：2677081