【摘要】：一.研究背景剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii,Tgondii)是一種專性細胞內(nèi)寄生原蟲,能夠感染大多數(shù)溫血動物。弓形蟲是頂復(fù)門原蟲的成員,由于弓形蟲的地理分布和中間宿主的多樣性,使得其成為世界上分布最廣的寄生蟲之一。弓形蟲在各種中間宿主中進行無性增殖,包括人類在內(nèi)。在感染中間宿主時,弓形蟲分化成速殖子,并迅速在宿主體內(nèi)傳播。雖然大多數(shù)速殖子被免疫系統(tǒng)清除,但一些速殖子轉(zhuǎn)變?yōu)榫徶匙?在腦和肌肉中形成相對靜止的組織包囊。在大多數(shù)免疫正常人群,弓形蟲感染為一過性甚至是無臨床表現(xiàn),而對于免疫低下人群則會造成弓形蟲眼病、弓形蟲腦病甚至死亡,對于孕婦會造成流產(chǎn)、畸胎、嚴重的先天性缺陷包括眼部疾病和發(fā)育遲緩甚至死胎等嚴重危害由于弓形蟲急性感染的危害性相對嚴重,以往的研究更多關(guān)注的是弓形蟲速殖子,而認為在腦和肌肉中形成的相對靜止的組織包囊在宿主體內(nèi)不起作用。但近幾年的研究表明,被弓形蟲感染的嚙齒動物表現(xiàn)出不尋常的行為反應(yīng):它們失去了對貓尿氣味的本能厭惡,反而被貓尿氣味吸引,這種行為改變看起來有利于弓形蟲由中間宿主向終宿主傳播。雖然這種行為操縱的確切機制尚不清楚,但是寄生于大腦中的弓形蟲能夠通過刺激宿主多巴胺(dopamine,DA)通路使其調(diào)控發(fā)生改變進而操縱宿主行為已被認為是一個可能的機制。有研究者已經(jīng)提出,速殖子在體外可以改變DA水平,腦內(nèi)包囊可以直接影響宿主大腦中的DA產(chǎn)生和DA突觸傳遞。另外,用于治療精神分裂癥的多巴胺受體拮抗劑氟哌啶醇,同時也能抑制弓形蟲增殖且用藥后患者抗弓形蟲抗體滴度水平下降。而抗精神病藥物聯(lián)合蒿甲醚治療能顯著改善精神分裂癥患者部分精神癥狀并且降低弓形蟲抗體陽性率。這都說明了弓形蟲感染可能與宿主腦內(nèi)多巴胺水平相關(guān),但其引起多巴胺改變的可能機制尚不清楚。在弓形蟲基因組包含兩個編碼芳香族氨基酸羥化酶:酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的基因,TgAaaH1和TgAaaH2。酪氨酸經(jīng)化酶將酪氨酸轉(zhuǎn)化為多巴胺前體左旋多巴(3,4二羥基苯丙氨酸,L-Dopa),是后續(xù)多巴胺合成的限速步驟。有研究表明弓形蟲中編碼的芳香族氨基酸羥化酶的AAH1和AAH2基因有助于弓形蟲向貓的傳播而完成有性生殖,在弓形蟲卵囊發(fā)育中起重大作用。由于AAH2在弓形蟲速殖子中以低水平表達,在緩殖子中表達上調(diào),以往更多對AAH2的功能進行研究。有研究發(fā)現(xiàn)AAH2基因不影響弓形蟲速殖子期的功能或感染宿主腦中多巴胺的全局或區(qū)域性改變,也不影響慢性弓形蟲感染BALB/c小鼠的DA依賴性神經(jīng)異常行為。但對于AAH2基因的功能存在爭議沒有定論,而對于在速殖子期和緩殖子期都有相當量表達的AAH1基因的功能研究較少。那么AAH1是否在弓形蟲的生長發(fā)育中有特殊功能或者參與了寄生蟲操縱宿主DA,進而影響宿主的行為改變?為了探究這種可能性,我們構(gòu)建了Ⅰ型RH株和Ⅱ型PRU株的AAH1基因敲除蟲株,探究AAH1基因在速殖子階段對弓形蟲入侵宿主細胞,在宿主細胞內(nèi)增殖和生長的影響;并且構(gòu)建動物模型以直接探究弓形蟲AAH1基因的敲除對弓形蟲急性感染小鼠毒力作用、弓形蟲慢性感染小鼠腦組織成囊能力的影響,以及通過監(jiān)測小鼠的行為來探究AAH1基因在弓形蟲緩殖子階段的功能。二.方法1.利用實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR.),構(gòu)建單拷貝pUC19-SAG1-AAH1質(zhì)粒作為基底對照,檢測AAH1基因在Ⅰ型RH株和Ⅱ型PRU株基因組中的拷貝數(shù)。2.應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù),在AAH1基因第7個外顯子定向插入乙胺嘧啶基因作為藥篩標簽,通過插入失活,以達到敲除AAH1基因功能目的,并在基因組及轉(zhuǎn)錄組水平證明插入失活。3.通過結(jié)晶紫染色、免疫熒光染色法量化弓形蟲在體外入侵HFF細胞、以及在細胞內(nèi)增殖和生長能力,通過CD-1小鼠腹腔感染速殖子建立急性小鼠感染模型,觀察弓形蟲AAH1基因敲除對感染小鼠的毒力作用的影響,來探究弓形蟲AAH1基因在速殖子期的功能。4.通過包囊經(jīng)口灌胃來建立慢性感染小鼠模型,觀察弓形蟲AAH1基因敲除株慢性感染小鼠腦組織內(nèi)包囊的空間分布,利用曠場實驗和Morris 水迷宮,觀察弓形蟲AAH1基因敲除株慢性感染小鼠的行為改變,來探究弓形蟲AAH1基因在緩殖子期功能。三.結(jié)果1.AAH1基因在RH和PRU株基因組中為單拷貝。2.成功構(gòu)建RHAAAH1和PRUAAAH1敲除株。3.建立弓形蟲急性和慢性感染的CD-1小鼠模型。4.弓形蟲AAH1基因敲除不影響弓形蟲對宿主細胞的入侵,在宿主細胞內(nèi)增殖和生長的能力,以及對弓形蟲急性感染小鼠的毒力作用。5.弓形蟲AAH1基因敲除會影響弓形蟲慢性感染小鼠腦腦組織整體包囊負荷和局部包囊的形成。6.弓形蟲AAH1基因敲除不影響弓形蟲慢性感染小鼠在曠場實驗中的自主行為和探索行為,以及在Morris水迷宮的空間學習相關(guān)行為,但會影響弓形蟲慢性感染小鼠在Morris水迷宮中記憶保持能力。四.結(jié)論AAH1基因的敲除不影響弓形蟲Ⅰ型RH株和Ⅱ型PRU株對宿主細胞的入侵、在宿主細胞內(nèi)的增殖和生長能力,以及對弓形蟲急性感染小鼠的毒力作用。同時,AAH1基因的敲除不影響弓形蟲Ⅱ型PRU株慢性感染小鼠在新環(huán)境中的自主行為、探索行為以及在Morris水迷宮中的學習相關(guān)行為,但是會影響弓形蟲Ⅱ型PRU株慢性感染小鼠腦內(nèi)包囊形成能力,以及在Morris水迷宮中的記憶相關(guān)行為。
【圖文】：

AAHI基因拷貝數(shù)鑒定的技術(shù)路線圖

圖１－２邋ＡＡＨ１基因敲除蟲株構(gòu)建的技術(shù)路線圖逡逑２．２引物設(shè)計及合成逡逑本實驗中引物均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，，具體見下表。逡逑表１－１本研究中所用引物逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－１邋Ｐｒｉｍｅｒｓ邋ｕｓｅｄ邋ｉｎ邋ｔｈｉｓ邋ｓｔｕｄｙ．逡逑引物名稱邐引物序列邐ｍ逡逑ＡＡＨｌ－Ｆ邐ＣＣＣ邋ＡＡＧＣＴＴＧＧＧＡＴＧＴＧＧＣ邋ＡＧＧＣＣ邋ＡＴＴＴＴＣＧＣＴＧ逡逑擴增ＡＡＨ１基因逡逑ＡＡＨ１－Ｒ邐ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＧＣＴＡＣ邋ＡＧ邋Ａ邋ＡＴＧ邋ＡＴＡＴＧＣ邋ＡＡＡＴＣＣ邋ＡＴＧ逡逑ＵＣｌ邋９－ＳＡＧ邋１－Ｆ邋５’－ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＣＣＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＡＧＴＧＣＣＣＴＡＡＡＡ邋擴增邋ＳＡＧ１邋片段構(gòu)建逡逑ｐＵＣ邋１９－Ｓ邋ＡＧ－Ｒ邐５，－ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＣＣ邋ＡＴＡＣ邋ＡＡＣＴＣＴＧＴＧＣＧＴＣＧＴ－３邋’邐ｐＵＣ邋１９－ＳＡＧ邋１邋－Ａ邋ＡＨ邋１逡逑１２逡逑
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R382.5

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本文編號：2677043