本文關(guān)鍵詞：鼠傷寒沙門氏菌spv基因回補(bǔ)株的構(gòu)建及其對(duì)腸粘膜上皮細(xì)胞凋亡的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:構(gòu)建穩(wěn)定的沙門氏菌表達(dá)載體,在此基礎(chǔ)上構(gòu)建鼠傷寒沙門氏菌spv基因回補(bǔ)株并研究其穩(wěn)定性。體外建立鼠傷寒沙門氏菌感染Henle-407的細(xì)胞模型,觀察沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvC對(duì)腸粘膜上皮細(xì)胞凋亡的影響及其分子機(jī)制。為探討鼠傷寒沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvC致病機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù),并為后續(xù)利用動(dòng)物模型進(jìn)行該基因功能的研究提供工具和手段。方法:一、鼠傷寒沙門氏菌spv基因熒光回補(bǔ)株的構(gòu)建及其穩(wěn)定性的研究。以低拷貝克隆載體pACYC-184為基礎(chǔ),根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的eGFP基因序列,上游增加Trc Promoter啟動(dòng)子,下游增加rrnB ribosomal終止子,兩端位點(diǎn)上、下游序列設(shè)計(jì)相應(yīng)酶切位點(diǎn),采用多重PCR的方法合成pACYC184-eGFP載體,并依次調(diào)取及克隆aphA-hok-parDE基因和spv基因,構(gòu)建得到pACYC184-eGFP-HOK載體、pACYC184-spvB-eGFP-HOK載體及pACYC184-spvC-eGFP-HOK載體,分別電轉(zhuǎn)化入對(duì)應(yīng)的鼠傷寒沙門氏菌spv基因缺陷變異株得到相應(yīng)的回補(bǔ)株,并對(duì)質(zhì)粒的穩(wěn)定性及熒光蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。二、沙門氏菌質(zhì)粒毒力基因spvC對(duì)腸粘膜上皮細(xì)胞凋亡的影響及其分子機(jī)制的研究。攜帶spv基因(Salmonella plasmid virulence genes)的野生型鼠傷寒沙門氏菌211、敲除spvC的缺陷變異株(ST211-△-e-spvC)及回補(bǔ)株(ST211-c-spvC)與Henle-407細(xì)胞共培養(yǎng),取不同干預(yù)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變和胞內(nèi)菌數(shù)量;Promega熒光素酶發(fā)光法檢測(cè)Caspase3/7活性;Western blot法檢測(cè)ERK和p-ERK表達(dá)水平;胞內(nèi)集落形成單位的檢測(cè)采用平板菌落計(jì)法。結(jié)果:一、鼠傷寒沙門氏菌spv基因回補(bǔ)株的構(gòu)建及其穩(wěn)定性的研究。1.經(jīng)PCR及基因測(cè)序證實(shí)成功構(gòu)建鼠傷寒沙門菌spvB、spvC基因熒光回補(bǔ)株。2.含有低拷貝質(zhì)粒的回補(bǔ)株在連續(xù)培養(yǎng)12代或144h都未發(fā)生丟失,在細(xì)菌感染細(xì)胞模型中用熒光顯微鏡可觀察到細(xì)菌帶綠色熒光。二、沙門氏菌質(zhì)粒毒力基因spvC對(duì)腸粘膜上皮細(xì)胞凋亡的影響及其分子機(jī)制的研究。1.熒光顯微鏡下ST211感染組與ST211-c-spvC感染組細(xì)胞在4h出現(xiàn)大量的細(xì)胞核呈波紋狀或折縫樣、部分染色質(zhì)凝聚等早期細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變,而ST211-△-e-spvC感染組及空白對(duì)照組無(wú)明顯凋亡形態(tài)學(xué)改變。感染24h,ST211感染組與ST211-c-spvC感染組細(xì)胞的染色質(zhì)高度凝聚邊緣化、產(chǎn)生凋亡小體并出現(xiàn)大量以壞死為特征的形態(tài)學(xué)改變,ST211-△-e-spvC僅部分細(xì)胞存在凋亡、壞死形態(tài)學(xué)改變。2.Caspase-3/7活性檢測(cè)結(jié)果顯示,各組Caspase-3/7活性隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)而升高,0h和4h,三個(gè)感染組間的Fluorescence值無(wú)明顯差異(P0.05);感染后4h,細(xì)菌感染組較空白對(duì)照組出現(xiàn)顯著差異(P0.01);感染的8h、12h和24h,ST211-△-e-spvC感染組較ST211-eGFP感染組和ST211-c-spvC感染組的Fluorescence值有差異(P0.05)。3.p-ERK蛋白的比值分別為(24h;空白對(duì)照組,0.89±0.03;ST211-eGFP感染組,0.12±0.02;ST211-△-e-spvC感染組,0.74±0.05;ST211-c-spvC感染組,0.11±0.04),ST211-eGFP感染組與ST211-c-spv C感染組的p-ERK蛋白的比值較ST211-△-e-spvC感染組顯著降低(P0.01)。4.共培養(yǎng)的前4h,組間胞內(nèi)活菌數(shù)無(wú)明顯差異(P0.05)。在干預(yù)后8h、12h和24h,ST211-eGFP感染組與ST211-c-spvC感染組胞內(nèi)活菌數(shù)高于ST211-△-e-spvC感染組(P0.05)。結(jié)論:1.高度穩(wěn)定且含有綠色熒光蛋白標(biāo)簽的沙門氏菌表達(dá)載體及spv基因回補(bǔ)株構(gòu)建成功,為深入研究鼠傷寒沙門菌毒力基因的功能奠定了基礎(chǔ)。2.沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvC可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活和增殖,進(jìn)而加重細(xì)胞損傷,這一作用可能與其影響ERK的磷酸化水平有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：鼠傷寒沙門氏菌 spv hok/sok parDE 細(xì)胞凋亡 MAPK
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R378
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 第1章 前言11-14
• 第2章 鼠傷寒沙門菌spv基因熒光回補(bǔ)株的構(gòu)建及其穩(wěn)定性研究14-40
• 2.1 材料14-17
• 2.1.1 菌株、質(zhì)粒14-15
• 2.1.2 主要試劑及儀器15-16
• 2.1.3 主要培養(yǎng)基及試劑配制16-17
• 2.2 方法17-33
• 2.2.1 技術(shù)路線17-22
• 2.2.2 eGFP基因（含啟動(dòng)子終止子）的合成及克隆22-26
• 2.2.3 HOK基因的調(diào)取及克隆26-28
• 2.2.4 spvB及spvC基因的調(diào)取及克隆28-32
• 2.2.5 電感受態(tài)細(xì)胞的制備及電轉(zhuǎn)化入沙門氏菌32-33
• 2.2.6 質(zhì)粒穩(wěn)定性評(píng)價(jià)33
• 2.3 結(jié)果33-38
• 2.3.1 PCR合成eGFP基因（含啟動(dòng)子終止子）33-34
• 2.3.2 eGFP基因（含啟動(dòng)子終止子）的克隆及鑒定34-35
• 2.3.3 hok/sok-par ED（簡(jiǎn)稱HOK）基因的調(diào)取35
• 2.3.4 hok/sok-par ED（簡(jiǎn)稱HOK）基因的克隆35-36
• 2.3.5 spvB及spvC基因的調(diào)取36
• 2.3.6 spvB及spvC基因的克隆36-37
• 2.3.7 平板計(jì)數(shù)法測(cè)量質(zhì)粒穩(wěn)定性結(jié)果37-38
• 2.4 討論38-40
• 第3章 沙門氏菌質(zhì)粒毒力基因spvC對(duì)腸粘膜上皮細(xì)胞凋亡的影響及其分子機(jī)制的研究40-53
• 3.1 材料40-42
• 3.1.1 菌株40
• 3.1.2 細(xì)胞株40
• 3.1.3 主要試劑及儀器40-41
• 3.1.4 主要培養(yǎng)基及試劑配制41-42
• 3.2 方法42-46
• 3.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)及定量42-43
• 3.2.2 細(xì)胞的分組及培養(yǎng)43
• 3.2.3 細(xì)胞感染模型的建立43-44
• 3.2.4 細(xì)胞爬片制備及DAPI染色44
• 3.2.5 Caspase-3/7 活性的檢測(cè)44
• 3.2.6 Western blot法檢測(cè)MAPK通路蛋白分子表達(dá)水平44-45
• 3.2.7 胞內(nèi)菌計(jì)數(shù)45
• 3.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析45-46
• 3.3 結(jié)果46-50
• 3.3.1 DAPI熒光染色觀察凋亡過(guò)程中細(xì)胞核形態(tài)學(xué)改變46-47
• 3.3.2 Promega熒光素酶發(fā)光法檢測(cè)Caspase3/7 活性47-48
• 3.3.3 Western blot法檢測(cè)MAPK通路蛋白分子表達(dá)水平48-49
• 3.3.4 胞內(nèi)菌計(jì)數(shù)結(jié)果49-50
• 3.4 討論50-53
• 第4章 結(jié)論和展望53-54
• 4.1 結(jié)論53
• 4.2 展望53-54
• 致謝54-55
• 參考文獻(xiàn)55-57
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果57-58
• 綜述58-66
• 參考文獻(xiàn)63-66

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本文編號(hào)：265281