【摘要】：目的:胸腺是機(jī)體重要的免疫器官,是孵育T淋巴細(xì)胞成熟的場(chǎng)所,來(lái)自骨髓的淋巴造血祖細(xì)胞(lymphohematopoietic progenitor cell,LPC)經(jīng)過血液循環(huán)進(jìn)入胸腺,與胸腺微環(huán)境相互作用并逐步向成熟的T淋巴細(xì)胞發(fā)育,最終經(jīng)胸腺移行到外周的免疫器官并發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。胸腺在青春期時(shí)重量達(dá)到最大,隨后便開始發(fā)生增齡性萎縮,是機(jī)體最早發(fā)生衰老的器官,胸腺老化主要表現(xiàn)為明顯的萎縮,以腺體變小,重量減低,細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和脂肪細(xì)胞的積累為特征。胸腺增齡性萎縮會(huì)引起免疫系統(tǒng)衰老和應(yīng)答免疫系統(tǒng)功能低下,進(jìn)而導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生、增加機(jī)體罹患癌癥及感染性疾病的危險(xiǎn)。近些年的研究表明,許多老年人常見的疾病,如糖尿病、心血管疾病等也可能與胸腺功能減退導(dǎo)致的免疫功能下降相關(guān)。胸腺基質(zhì)細(xì)胞是胸腺微環(huán)境的主要組成部分,包含胸腺上皮細(xì)胞(thymus epithelial cell,TEC)、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(deutrtic cell,DC)等,有研究表明,胸腺內(nèi)的脂肪細(xì)胞主要是由成纖維細(xì)胞分化發(fā)育而來(lái),然而胸腺內(nèi)的成纖維細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化發(fā)育的機(jī)制卻并不清楚。因此研究胸腺脂肪化的分子機(jī)制,為進(jìn)一步探究胸腺的發(fā)育和萎縮的分子機(jī)制,對(duì)提高機(jī)體免疫力、延緩免疫系統(tǒng)衰老至關(guān)重要。研究方法:1、原代胸腺基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定:選取出生3天內(nèi)的小鼠胸腺,利用酶消化方法提取原代的小鼠胸腺基質(zhì)細(xì)胞(thymic stromal cell,TSC),流式細(xì)胞術(shù)及細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞的表型。使用過氧化物酶體增殖激活物受體γ(peroxisome proliferators-activated receptorγ,PPARγ)的激動(dòng)劑羅格列酮,誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的TSCs分化成為脂肪細(xì)胞,二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)處理的細(xì)胞作為對(duì)照,油紅O染色檢測(cè)脂滴的形成情況,Real-time PCR檢測(cè)成脂相關(guān)基因PPARγ、FABP4(fatty acid binding protein 4)的mRNA表達(dá)水平。2、TSCs向脂肪細(xì)胞分化過程中差異表達(dá)lncRNA和mRNA的篩選:DMSO組及羅格列酮誘導(dǎo)組各取三組樣本,采用高通量測(cè)序技術(shù)(High-throughput Sequencing),以篩選的閾值為qvalue0.05(若qvalue0.05篩選差異基因過少則使用pvalue0.05進(jìn)行差異篩選)作為篩選TSCs向脂肪細(xì)胞分化過程中差異表達(dá)的lncRNA和mRNA標(biāo)準(zhǔn),并對(duì)篩選后差異表達(dá)的lncRNA和mRNA進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類分析、GO分析(gene ontology,GO)和KEGG分析(kyoto encyclopedia of genes and genomes),使用Real-time PCR驗(yàn)證所篩選出的與成脂相關(guān)基因的表達(dá)變化。3、Notch信號(hào)通路在TSCs向脂肪細(xì)胞分化過程中的作用:使用Real-time PCR檢測(cè)在羅格列酮將TSCs誘導(dǎo)分化成為脂肪細(xì)胞的過程中Notch信號(hào)通路受體(Notch1~4)、配體(DLL1、DLL4、Jagged1、Jagged2)及下游靶基因(Hes1、Hey1)的表達(dá)變化,隨后過表達(dá)或抑制Notch1,油紅O染色和Adipored染色觀察脂滴的形成,Real-time PCR檢測(cè)PPARγ、FABP4的mRNA表達(dá)水平。4、Notch信號(hào)通路與自噬共同調(diào)節(jié)TSCs的脂肪化:Western blot檢測(cè)羅格列酮誘導(dǎo)TSCs后0、1、3、5、7天時(shí)自噬相關(guān)蛋白LC3、p62的蛋白表達(dá)水平。Western blot檢測(cè)不同濃度的Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT(0、1、2、5、10μm)處理TSCs后自噬相關(guān)蛋白LC3、p62及自噬相關(guān)通路p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR的蛋白表達(dá)水平。在羅格列酮誘導(dǎo)TSCs的過程中同時(shí)使用Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT及自噬抑制劑3-MA,油紅O染色和Adipored染色觀察脂滴的形成情況,Real-time PCR檢測(cè)PPARγ、FABP4的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果:1、原代TSCs的提取與鑒定:提取的原代TSCs大多數(shù)呈成纖維細(xì)胞樣,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示約97%的細(xì)胞呈CD45~-S100A4~+表型,細(xì)胞免疫熒光結(jié)果也顯示多數(shù)的細(xì)胞呈S100A4~+表型,說(shuō)明多數(shù)的TSCs為成纖維細(xì)胞;2、羅格列酮誘導(dǎo)原代TSCs向脂肪細(xì)胞分化:分別用DMSO和10μm羅格列酮對(duì)TSCs進(jìn)行處理,(1)油紅O染色結(jié)果DMSO對(duì)照組中并無(wú)脂滴形成,而羅格列酮處理組有大量的脂滴出現(xiàn);(2)Real-time PCR檢測(cè)脂肪形成相關(guān)基因PPARγ與FABP4的mRNA水平,發(fā)現(xiàn)羅格列酮誘導(dǎo)組中,兩個(gè)基因的表達(dá)較對(duì)照組明顯增高;3、篩選TSCs向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中差異表達(dá)的lncRNA及mRNA:(1)高通量測(cè)序一共篩選出1737個(gè)差異表達(dá)的mRNA(965個(gè)上調(diào)和772個(gè)下調(diào))、45個(gè)差異表達(dá)的lncRNA(29個(gè)上調(diào)和16個(gè)下調(diào))和31個(gè)差異表達(dá)的不確定編碼潛能的轉(zhuǎn)錄本(transcripts of uncertain coding potential,TUCP)(14個(gè)上調(diào)和17個(gè)下調(diào));(2)利用非監(jiān)督層次聚類的方法對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,分別使用差異表達(dá)的lncRNA、TUCP的靶基因和mRNA產(chǎn)生熱圖,它們清楚地被分離成Rosi和對(duì)照簇,同組樣本聚在同一簇中;(3)GO顯著性富集分析結(jié)果顯示篩選得到的差異基因無(wú)論是mRNA、lncRNA還是TUCP都主要是在細(xì)胞代謝、有機(jī)物質(zhì)代謝、氮化合物代謝等過程中顯著富集;(4)篩選得到的差異mRNA在PPARγ、胰島素、環(huán)磷酸腺苷(Cyclic Adenosine monophosphate,cAMP)及泛素化介導(dǎo)的蛋白水解相關(guān)的信號(hào)通路發(fā)生顯著富集,篩選到的差異lncRNA主要在絲裂原活化蛋白激酶(Mtogen-activated protein kinase,MAPK)、泛素化蛋白水解、過氧化物等信號(hào)通路發(fā)生顯著富集,篩選到的差異TUCP在癌癥、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等信號(hào)通路發(fā)生顯著富集;4、Notch信號(hào)通路在TSCs脂肪化中的作用:(1)Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示在TSCs向脂肪細(xì)胞分化過程中Notch信號(hào)通路的受體Notch1、配體Jagged1及靶基因Hey1的表達(dá)下降,而配體DLL1的表達(dá)升高;(2)構(gòu)建攜帶Notch1基因的腺病毒,并轉(zhuǎn)入TSCs中,Western Blot結(jié)果顯示Notch1過表達(dá)后,胞漿內(nèi)Notch1及胞核內(nèi)Notch1活化片段N1ICD的蛋白水平表達(dá)升高,Real-time PCR結(jié)果顯示Notch信號(hào)通路下游靶基因Hey1的表達(dá)升高;(3)對(duì)過表達(dá)Notch1基因的TSCs進(jìn)行羅格列酮誘導(dǎo),油紅O染色和AdipoRed染色結(jié)果顯示脂肪滴的形成受到抑制。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示成脂相關(guān)基因FABP4的mRNA表達(dá)水平出現(xiàn)下降;(4)DAPT和si-Notch1作用于TSCs,胞漿內(nèi)Notch1及胞核中N1ICD的蛋白水平下降,同時(shí)Notch信號(hào)通路的下游靶基因Hey1的mRNA水平也出現(xiàn)下降;(5)DAPT和si-Notch1抑制Notch信號(hào)通路的同時(shí)添加羅格列酮誘導(dǎo)TSCs向脂肪細(xì)胞分化,油紅O染色和AdipoRed染色結(jié)果顯示脂肪滴的形成增多,成脂相關(guān)因子PPARγ及FABP4的mRNA表達(dá)水平在抑制Notch信號(hào)通路后表達(dá)出現(xiàn)上升;5:Notch信號(hào)通路與自噬共同調(diào)節(jié)TSCs向脂肪細(xì)胞分化:(1)分別在羅格列酮處理TSCs后的第0、1、3、5、7天收集細(xì)胞并提取蛋白,western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示自噬相關(guān)指標(biāo)LC3、Becline1蛋白水平無(wú)明顯變化,p62的蛋白表達(dá)水平降低;(2)用不同濃度的DAPT(0、1、2、5、10μm)對(duì)TSCs進(jìn)行處理,48h后收集細(xì)胞并提取蛋白,western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示自噬相關(guān)指標(biāo)LC3-II/LC3-I隨DAPT濃度的增高而呈現(xiàn)逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì),p62蛋白水平出現(xiàn)了降低,p-AKT/AKT與p-mTOR/mTOR的蛋白表達(dá)水平降低;(3)添加自噬的抑制劑3-MA,同時(shí)添加或不添加Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT,油紅O染色和AdipoRed染色結(jié)果顯示使用3-MA抑制自噬后脂肪滴的形成減少,同時(shí)還可以部分逆轉(zhuǎn)DAPT導(dǎo)致的脂肪滴形成的增加,在DAPT處理TSCs的同時(shí)添加了3-MA,PPARγ及FABP4的表達(dá)較單獨(dú)使用DAPT組下降。結(jié)論:1、在羅格列酮誘導(dǎo)的TSCs向脂肪細(xì)胞分化過程中有1737個(gè)mRNA(965個(gè)上調(diào)和772個(gè)下調(diào))、45個(gè)lncRNA(29個(gè)上調(diào)和16個(gè)下調(diào))和31個(gè)TUCP(14個(gè)上調(diào)和17個(gè)下調(diào))表達(dá)發(fā)生明顯的改變;2、調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路水平可以影響TSCs向脂肪細(xì)胞分化的過程;3、抑制Notch信號(hào)通路可通過提高自噬水平來(lái)促進(jìn)TSCs向脂肪細(xì)胞的分化。
【圖文】：

3.1 原代 TSCs 的提取與鑒定首先，我們根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道的酶消化方法進(jìn)行原代 TSCs 的提取，從細(xì)胞形態(tài)看，大多數(shù)的TSCs呈成纖維細(xì)胞樣(圖3.1A)。S100A4(S100 calcium binding proteinA4)又稱 FSP1，是成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，在經(jīng)過 2 次傳代后，我們對(duì)所提取的細(xì)胞應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行鑒定，如圖所示約 97%的細(xì)胞呈 CD45-S100A4+表型(圖3.1B)，細(xì)胞免疫熒光結(jié)果也顯示多數(shù)的細(xì)胞呈 S100A4+表型(圖 3.1C)，說(shuō)明經(jīng)過傳代后，胸腺細(xì)胞已被篩除，而剩余的 TSCs 多數(shù)為成纖維細(xì)胞，我們的結(jié)果與之前Yang 等的結(jié)果一致

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3.2 羅格列酮誘導(dǎo)原代 TSCs 向脂肪細(xì)胞分化油紅 O 為一種脂溶性的染料，，在脂肪內(nèi)能高度的溶解，可特異性的使組織或細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯著色，是檢測(cè)脂滴形成的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法。我們分別用 DMSO 和 10μM 羅格列酮對(duì) TSCs 進(jìn)行處理，7 天后，利用油紅 O 染色檢測(cè)脂滴形成情況，從圖中可以看出，DMSO 對(duì)照組中并無(wú)脂滴形成，而羅格列酮處理組有大量的脂滴出現(xiàn)(圖 3.2A)，同時(shí)，我們檢測(cè)了脂肪形成相關(guān)基因 PPARγ 與 FABP4 的 mRNA 水平，發(fā)現(xiàn)羅格列酮誘導(dǎo)組中，兩個(gè)基因的表達(dá)明顯較 DMSO 處理組高(圖 3.2B)。以上結(jié)果均說(shuō)明 TSCs 可以被羅格列酮誘導(dǎo)向脂肪細(xì)胞分化。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 張一鳴;譚曉開;王銘遠(yuǎn);李呼倫;;調(diào)節(jié)性B細(xì)胞與自身免疫性疾病[J];國(guó)際免疫學(xué)雜志;2017年02期

2 賈佳;鄭凱;;耐受性樹突狀細(xì)胞在自身免疫中的作用[J];國(guó)際免疫學(xué)雜志;2017年01期

本文編號(hào)：2630162