【摘要】：目的類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderia pseudomallei,B.pseudomallei,簡稱類鼻疽桿菌)作為一種正在擴散的人獸共患傳染病病原菌,能夠?qū)е路Q為類鼻疽(melioidosis)的熱帶醫(yī)學(xué)疾病,病死率高達(dá)40%。由于類鼻疽桿菌可在人體潛伏數(shù)十年后發(fā)病,故類鼻疽也被稱為“不定時炸彈”。細(xì)菌分泌系統(tǒng)在其致病中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用,包括Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type three secretion system,T3SS)。BPSS1395基因定位于類鼻疽桿菌的T3SS,目前功能未知。通過生物信息學(xué)和BLAST比對發(fā)現(xiàn)與之同源性較高的蛋白是青枯桿菌的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子HrpF(hypersentive response and pathogenicity F),屬于其T3SS效應(yīng)蛋白。我們推測BPSS1395可能是類鼻疽桿菌T3SS的轉(zhuǎn)運和定向元件。因此,本研究擬通過基因工程技術(shù)重組表達(dá)具有生物活性的BPSS1395蛋白并制備其抗體,確定其亞細(xì)胞定位;同時,構(gòu)建類鼻疽桿菌BPSS1395基因敲除株,通過感染番茄植株證實BPSS1395在類鼻疽桿菌感染植物中的重要作用。以上實驗將為深入研究類鼻疽桿菌作為一種潛在的植物病原造成人的感染和傳播作用機制奠定基礎(chǔ)。方法1.采用PCR擴增類鼻疽桿菌BPSS1395基因,目的基因與p ET-22b載體質(zhì)粒通過Bam HⅠ/XhoⅠ雙酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)回收、連接后轉(zhuǎn)化Escherichia coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,獲得陽性重組子,經(jīng)雙酶切和DNA測序驗證。2.篩選得到的陽性工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白并鑒定其表達(dá)形式,洗滌BPSS1395蛋白包涵體,通過復(fù)性得到可溶的BPSS1395蛋白。3.以復(fù)性BPSS1395蛋白免疫家兔,制備抗BPSS1395血清;Western blot、ELISA及免疫熒光分析其免疫學(xué)性質(zhì)。4.通過超速離心機分離全菌各組分,Western blot分析BPSS1395蛋白的亞細(xì)胞定位。5.利用同源重組技術(shù)構(gòu)建類鼻疽桿菌BPSS1395基因敲除菌株:PCR擴增類鼻疽桿菌BPSS1395基因上下游同源臂,連接至p K18mobSac B自殺質(zhì)粒上,通過大腸桿菌S17-1λpir以接合方式將其轉(zhuǎn)入類鼻疽桿菌中,而后蔗糖篩選獲得基因敲除突變菌株,PCR、DNA測序鑒定敲除菌株。6.類鼻疽桿菌野生株、BPSS1395基因敲除菌株和EHEC O157:H7對照組分別感染番茄植株根部,觀察植株及葉片的生長情況,PCR鑒定植物基因組中的細(xì)菌,電鏡觀察植株葉片病理學(xué)變化。結(jié)果:1.PCR獲得了全長870bp BPSS1395目的基因,構(gòu)建了表達(dá)重組質(zhì)粒的陽性工程菌pET-22b-BPSS1395/BL21(DE3)。2.陽性工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),包涵體洗滌、復(fù)性獲得了分子量為32k Da BPSS1395重組蛋白。3.該蛋白免疫家兔抗血清ELISA效價達(dá)1:1280000,并能與目的蛋白及類鼻疽桿菌全菌發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)。4.BPSS1395蛋白在類鼻疽桿菌中主要定位于細(xì)胞質(zhì)。5.成功構(gòu)建了類鼻疽桿菌BPSS1395基因敲除突變菌株。6.類鼻疽桿菌野生株和BPSS1395基因敲除株分別感染番茄植株后,雖然野生株與敲除株感染后葉片未見明顯變化,但是電鏡觀察發(fā)現(xiàn)野生型感染組植物葉片的組織結(jié)構(gòu)中有類鼻疽桿菌存在,同時PCR擴增出特異性類鼻疽桿菌基因,而敲除株感染組沒有。結(jié)論:本課題采用基因工程技術(shù)重組表達(dá)了具有生物活性的BPSS1395蛋白,并確定了其亞細(xì)胞定位;制備了BPSS1395多克隆抗體,為研究該細(xì)菌及其蛋白的功能提供了有效工具;利用同源重組技術(shù)構(gòu)建了BPSS1395基因敲除菌株,通過感染番茄植株證實了BPSS1395在類鼻疽桿菌感染植物中的重要作用。以上研究對深入研究類鼻疽桿菌作為一種潛在的植物病原造成人的感染和傳播作用機制以及類鼻疽桿菌的防治具有重要的理論指導(dǎo)意義。
【圖文】：

DNA 相對分子量；1：BPSS1395 基因擴增產(chǎn)圖 1 BPSS1395 基因擴增的瓊脂糖凝膠電泳 pET-22b-BPSS1395 的酶切鑒定-BPSS1395 轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌 DH5α，得到約為 870bp 的目的片段及載體質(zhì)目的基因 DNA 測序，結(jié)果見附錄 一致。

對分子量；1 和 2：pET-22b 空 質(zhì) 粒和質(zhì) 粒 pET-22b-BPⅠ/XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物；3：BPSS1395 的 PCR 產(chǎn)物圖 2 pET-22b-BPSS1395 重組質(zhì)粒的酶切鑒定BPSS1395 的制備 BPSS1395 的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)形式鑒定菌經(jīng)搖瓶培養(yǎng)，在 OD600達(dá)到 0.6-0.8 時加入 IP6h、5h、3h。從圖 3 SDS-PAGE 電泳結(jié)果可以看2kDa 位置均增加了一條蛋白條帶，與 BPSS1395軟件分析發(fā)現(xiàn)：誘導(dǎo)溫度在 16℃、25℃和 37℃表 4）。從超聲破碎后的上清和沉淀的 SDS-P誘導(dǎo)后菌液的上清幾乎沒有目的蛋白，，而大果說明了表達(dá)的重組蛋白主要是以包涵體形
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78;R378

【參考文獻(xiàn)】

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1 胡治強;方瑤;朱攀;任春艷;胡藝;馬騰飛;毛旭虎;;類鼻疽伯克霍爾德菌BPSL1549基因敲除株的構(gòu)建及鑒定[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2016年11期

2 劉巖巖;馬國舉;廖海印;張鷺;王洪海;;結(jié)核分枝桿菌Rv0859基因的克隆、表達(dá)、純化及蛋白的亞細(xì)胞定位[J];微生物學(xué)通報;2009年01期

3 王蔚淼;潘玲;;細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J];畜牧與獸醫(yī);2006年06期

本文編號：2584025