【摘要】：繼核酸和蛋白質(zhì)組學研究之后,人類又發(fā)現(xiàn)了承載著生物信息的大分子——聚糖,它被稱作是“DNA-mRNA-蛋白質(zhì)”遺傳信息流的延續(xù)。在生命體內(nèi),蛋白質(zhì)糖基化作為翻譯后修飾的一部分,在生命過程中發(fā)揮了非常重要的作用,因此對聚糖的研究吸引了人們的目光。但是由于糖鏈結(jié)構(gòu)非常復雜而且它不是由基因直接翻譯表達的產(chǎn)物,因此對糖生物功能的系統(tǒng)分析困難重重,為了解決這一難題,科學家們提出糖組學這一全新研究理論。在糖組學研究中,人們試圖通過對機體內(nèi)糖鏈、糖蛋白等進行研究以闡明基因功能及細胞功能。研究表明,蛋白糖基化現(xiàn)象與腫瘤的形成與發(fā)展有一定相關(guān)性,因此分析蛋白糖基化修飾對于研究腫瘤的機制及臨床診斷治療意義重大,這極大地推動了腫瘤早期診斷技術(shù)的進步。本課題在加州大學戴維斯分校Lebrilla B.Carlito課題組完成,采用該課題組創(chuàng)建的糖蛋白定量測定方法,即采用超高效液相色譜聯(lián)合三重四級桿質(zhì)譜(UPLC-QqQMS/MS)對生物血清中免疫球蛋白IgG、IgA和IgM上的糖蛋白進行定量測定。該方法與之前常用的糖鏈定量方法相比,具有以下優(yōu)點:(1)減少了分析樣品的取樣量。由于糖鏈在整個蛋白中所占比例極低,而且糖鏈在質(zhì)譜中的響應較差,極易受到其他物質(zhì)的干擾,因此傳統(tǒng)方法中對糖鏈進行分析時,需要加大樣品取樣量。而在本方法中我們是對N-糖肽進行分析,即對糖鏈及其連接的肽段進行同時測定,從而大大增加了待測物在整個樣品中所占比例,而且N-糖肽在質(zhì)譜中響應較好。在該方法中,樣品取樣量由傳統(tǒng)的50μL減少到2μL,大大縮減了取樣量,降低了基質(zhì)等對樣品測定時信號響應的干擾,更重要的是減少了取樣對機體造成的損傷;(2)前處理方法節(jié)約成本,操作簡便,重現(xiàn)性好。由于該方法是對糖蛋白進行定量,因此不需要PNGase F等糖苷酶進行糖鏈釋放等前處理,從而縮減了研究成本,省略了糖鏈提取所需要的固相萃取、上清液揮干等復雜且費時的操作步驟,在簡化操作的同時,克服了由于PNGase F酶切不完全導致糖鏈定量重現(xiàn)性低等缺點;(3)同時得到糖基化位點與糖蛋白信息。由于傳統(tǒng)的糖鏈分析是將糖鏈從糖蛋白上釋放出來,丟失了糖鏈所連接的糖蛋白與糖基化位點信息,僅僅對同類的糖鏈進行定量。新定量方法提供了對蛋白的絕對定量及帶有蛋白位點信息糖基化譜,這為判斷糖譜的變化是由蛋白糖基化引起還是由蛋白濃度變化引起提供了重要的依據(jù),增加分析結(jié)果的可信度。對同一肽段連接的相同糖鏈以及不同肽段連接的相同糖鏈進行比較,通過細化的分類,使可能存在的具有統(tǒng)計學差異的糖蛋白更容易被發(fā)現(xiàn)。經(jīng)實驗驗證,該方法操作簡便、結(jié)果穩(wěn)定可靠、重現(xiàn)性好,為尋找疾病中糖蛋白相關(guān)的生物分子標志物提供了重要的方法支持。在本課題研究中,我們采用以上建立的n-糖肽定量新方法,對胃癌n-糖肽生物分子標志物進行研究。在本研究中,我們選用兩組生物樣品(兩組生物樣品均含有胃炎患者血清與胃癌患者血清),首先對兩組生物樣品同時進行分析測定,通過對第一組數(shù)據(jù)進行t-檢驗分析,得到胃炎患者血清與胃癌患者血清中igg、iga和igm上具有顯著性差異的蛋白與n-糖肽,作為潛在的胃癌生物標志物;然后將以上發(fā)現(xiàn)的潛在生物標志物應用于第二組樣品分析中,采用rlanguage進行最小二乘法(partialleastsquares,pls)分析,觀察潛在的生物標志物能否將胃炎與胃癌兩組病人分開。分析結(jié)果表明,通過對約60種不同的糖蛋白進行統(tǒng)計分析,找到7個具有顯著性差異的糖蛋白,通過應用這7種糖蛋白對測試組進行pls分析,結(jié)果表明,胃炎患者與胃癌患者之間已出現(xiàn)一定的分離趨勢。在本研究中,我們不僅僅對胃癌血清免疫球蛋白n-糖肽分子生物標志物進行分析,同時對目前治療癌癥具有廣闊發(fā)展前景的的生物藥物重組單克隆抗體(recombinantmonoclonalantibody,rmab)進行了n-糖基化研究。重組單克隆抗體藥物作為一種有效治療癌癥和慢性疾病的生物藥物一經(jīng)上市就受到高度重視。該類藥物具有分子靶向性,其抗癌機理如下:(1)能夠激活人體自身免疫系統(tǒng)殺死腫瘤細胞;(2)阻斷腫瘤細胞的信號轉(zhuǎn)導,改變細胞基因表達,從而抑制或殺死腫瘤細胞;(3)能夠攜帶放射性抗腫瘤藥物靶向性地抵達腫瘤細胞,從而殺死腫瘤細胞。目前,已有30多種重組單克隆抗體經(jīng)fda批準進入市場,同時有上百種候選藥物正在進行臨床實驗。由此可見,該類藥物在抗腫瘤等慢性疾病治療上表現(xiàn)出色,具有很大發(fā)展空間,這也吸引了眾多藥企對rmabs藥物的開發(fā)與生產(chǎn)。到目前為止,所有經(jīng)批準的rmabs藥物都屬于免疫球蛋白igg,但是igg的四個亞型igg1、igg2、igg3和igg4都具有不同的藥效,因此根據(jù)疾病來選擇igg亞型給藥對于該類藥物的使用至關(guān)重要。同時,有研究表明,該類藥物的n-糖基化直接影響到藥物特性,甚至影響到該類藥物與細胞結(jié)合、激活等作用,而且rmabs作為生物藥物,其批間與批內(nèi)穩(wěn)定性非常關(guān)鍵。因此對igg亞型的快速鑒定以及對藥物中n-糖鏈的種類與n-糖基化位點定量測定是rmabs藥物在研發(fā)與生產(chǎn)過程的關(guān)鍵步驟。在這類藥物快速發(fā)展的背景下,建立對其進行n-糖基化譜與n-糖基化位點相關(guān)的定量分析高通量方法成為亟待解決的問題。在本課題研究中,我們采用uplc-qqq-ms/ms建立了對rmabs藥物中n-糖肽進行定量的高通量分析方法。在該方法中,省略了蛋白的富集與n-糖鏈釋放等步驟,對n-糖肽直接分析,建立了rmabs藥物的n-糖肽譜,并且通過mrm質(zhì)譜分析方法對藥物中的n-糖肽進行快速測定。方法驗證結(jié)果表明,該方法操作簡便、快速、可靠、重現(xiàn)性好。在該方法基礎(chǔ)上,我們對六種已上市的rMAbs藥物的N-糖肽進行定量分析,結(jié)果表明,雖然構(gòu)成藥物的IgG亞型不同,但是各亞型中包含的主要糖鏈及其含量基本一致。進一步地,我們建立了rMAbs藥物N-糖基化位點定量分析方法。當使用PNGase F酶切N-糖鏈后,與該糖鏈相連的肽段中的Asn(114.043Da)殘基轉(zhuǎn)變?yōu)锳sp殘基(115.027Da),分子量增加0.984Da,從而可以通過測定這種分子量上的變化對肽段進行定量分析。本研究根據(jù)這一特性,對rMAbs藥物中的糖鏈采用PNGase F進行酶解,對殘留的肽段進行MRM質(zhì)譜分析,通過對肽段標準品進行線性回歸,得到藥物中N-糖基化與未糖基化的肽段的絕對質(zhì)量。在本課題中,我們對六種rMAbs中N-糖基化位點進行定量測定,實驗結(jié)果表明,不論藥物屬于何種IgG亞型,N-糖基化的糖蛋白在97%以上,說明rMAbs藥物中絕大多數(shù)N-糖基化位點都被N-糖鏈所占據(jù)。本課題建立了快速、高效、準確、可靠的N-糖肽定量分析MRM方法,主要對胃癌與目前有效的抗癌藥物重組單克隆抗體的N-糖肽進行定量分析,為后續(xù)的疾病N-糖肽分子標志物的探索以及重組單克隆抗體藥物的質(zhì)量標準檢測與新藥研發(fā)提供了重要的方法依據(jù)。
【圖文】：

圖 1-1 N-糖鏈、O-糖鏈結(jié)構(gòu)與相應糖蛋白模型。（a）N-糖基化類型；（b）O-糖基化核心結(jié)構(gòu)；（c）N-連接與 O-連接糖蛋白。三、蛋白糖基化研究的意義糖基化在生命機體中發(fā)揮了非常重要的作用，涉及到生理、病理等眾多方面。在特定的狀態(tài)下，糖蛋白量的變化和/或其糖鏈結(jié)構(gòu)的改變，能夠體現(xiàn)特定的生理、病理過程[7]。在免疫系統(tǒng)中起到關(guān)鍵作用的分子基本上都是糖蛋白，這類糖蛋白主要位于細胞膜表面，生物機體血清中免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）糖鏈的異常，可能會導致機體自身免疫性疾病，這類疾病包括類風濕關(guān)節(jié)炎、甲狀腺炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和艾滋病等[8]。在對癌細胞與腫瘤細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，這些細胞表面的糖鏈會出現(xiàn)不同于正常細胞的狀態(tài)，例如他們的糖鏈會發(fā)生唾液酸化、β-1，6-N-乙酰葡糖胺化、巖藻糖化等糖鏈結(jié)構(gòu)的變化。研究結(jié)果表明，細胞中糖鏈結(jié)構(gòu)的異常變化、糖鏈數(shù)量的改變以及糖基化情況的變化普遍存在于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，如膜糖蛋白在細胞外

圖 1-2 ESI 電噴霧電離原理ESI 源通常是由帶有高電壓的電噴霧毛細管、電噴霧毛細管與連通高真空區(qū)的孔之間的電位差還有一些去溶劑裝置組成。圖 1-2 所示為正離子條件下的 ESI 。電噴霧尖端的電場（Ec）與電噴霧針的尺寸和所加電壓(Vc)成一定比例關(guān)系：Ec= ln(4 ) 公式中 rc是噴針的半徑，，d 是噴針與反轉(zhuǎn)電極之間的距離。2、常用質(zhì)譜檢測器（1）四級桿質(zhì)譜四級桿質(zhì)譜廣泛應用于各個領(lǐng)域，一般采用單四級桿或三重四級桿作為質(zhì)量分工具，也可以作為離子傳輸裝置來選擇離子。與飛行時間質(zhì)譜（TOF）和傅立葉
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Mitsuro Kanda;Yasuhiro Kodera;;Recent advances in the molecular diagnostics of gastric cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2015年34期

本文編號：2582530