【摘要】：滅活病毒及病毒樣顆粒(Virus like particles, VLPs)是兩類重要的疫苗抗原,都具有多聚亞基的大顆粒組裝體結(jié)構(gòu),在生產(chǎn)和儲(chǔ)存過程中易于發(fā)生結(jié)構(gòu)變化,影響疫苗的安全性和有效性。如何穩(wěn)定這種大顆粒組裝體結(jié)構(gòu)是疫苗工程研究領(lǐng)域的一個(gè)重要課題。本論文以滅活口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus, FMDV)及乙肝病毒表面抗原病毒樣顆粒(Hepatitis B virus surface antigen VLPs, HBsAg-VLPs)為對(duì)象,研究了其溶液中和固/液界面上顆粒結(jié)構(gòu)變化的檢測方法,分析了層析純化中顆粒結(jié)構(gòu)變化的機(jī)理,探索了影響結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的因素,主要內(nèi)容如下：1)建立了高效液相凝膠過濾色譜法(HPSEC)快速檢測和分析抗原顆粒組裝體結(jié)構(gòu)的技術(shù),應(yīng)用于FMDV、HBcAg-VLPs、HBsAg-VLPs在不同生產(chǎn)階段以及儲(chǔ)存溶液中顆粒完整性的檢測,與傳統(tǒng)的超高速離心分析法相比,具有簡單、快速、可靠等優(yōu)點(diǎn)。該方法經(jīng)中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所推薦,已被疫苗生產(chǎn)企業(yè)使用。2)分析了溶液中FMDV和HBsAg-VLPs的顆粒性質(zhì),采用場流分級(jí)、圓二色光譜、熒光光譜、動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)對(duì)兩種抗原進(jìn)行了表征,進(jìn)一步證實(shí)了HPSEC方法的可靠性,同時(shí)提供了更為全面的結(jié)構(gòu)變化的信息。3)探索了雙偏極化干涉(DPI)分析抗原顆粒在液固相界面的變化,發(fā)現(xiàn)HBsAg-VLPs在DEAE離子交換表面發(fā)生吸附,其厚度隨pH不同而變化。在pH5.0下,平均吸附層厚度高于HBsAg-VLPs的顆粒直徑；在pH值7.0或9.0下,平均吸附層厚度則小于HBsAg-VLPs的顆粒直徑,說明病毒樣顆粒在離子交換中可能出現(xiàn)復(fù)雜的結(jié)構(gòu)變化。通過對(duì)比DPI分析和離子交換層析純化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,證明了HBsAg-VLPs在離子交換層析中的活性損失與界面失活密切相關(guān)。4)建立了提高顆粒型抗原在生產(chǎn)過程中穩(wěn)定性的策略。對(duì)于FMDV,最適pH范圍在7.5-8.0,最適的鹽類為銨鹽。通過HPSEC及差示掃描量熱法(DSC)證實(shí)了添加多羥基化合物對(duì)于疫苗抗原的顆粒結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用。當(dāng)溶液中存在多羥基化合物時(shí),超濾過程中的FMDV收率提高了10.4%,離子交換層析的收率從17.1%提高到了84.0%。整個(gè)工藝獲得的FMDV完整顆粒(146S)的純度達(dá)到98%以上,整體收率達(dá)到56.7%。
[Abstract]:Inactivated virus and virus-like particle (Virus like particles, VLPs) are two kinds of important vaccine antigens, both of which have a large particle assembly structure with poly-subunits, and are prone to structural changes during production and storage, which will affect the safety and effectiveness of the vaccine. How to stabilize the structure of this large particle assembly is an important subject in vaccine engineering. In this paper, inactivated foot-and-mouth disease virus (Foot and mouth disease virus, FMDV) and hepatitis B virus surface antigen virus like particle (Hepatitis B virus surface antigen VLPs, HBsAg-VLPs) were used to detect the changes of particle structure at the solid / liquid interface. The mechanism of particle structure change in chromatographic purification was analyzed, and the factors influencing the structure stability were explored. The main contents are as follows: 1) High performance liquid phase gel filtration chromatography (HPSEC) was established for rapid detection and analysis of antigen particle assembly structure, which was applied to FMDV,HBcAg-VLPs,. Compared with the traditional ultra-high speed centrifugation, HBsAg-VLPs has the advantages of simplicity, rapidity, reliability and so on. The method has been recommended by the China Veterinary Drug Administration and has been used by vaccine manufacturers. 2) the particle properties of FMDV and HBsAg-VLPs in the solution were analyzed by field flow classification, circular dichroism spectrum and fluorescence spectrum. The dynamic light scattering technique was used to characterize the two antigens, which further confirmed the reliability of the HPSEC method. At the same time, it provides more comprehensive information on the structural changes. 3) the changes of antigenic particles at the liquid-solid interface are analyzed by dual-polarization interference (DPI). It is found that HBsAg-VLPs adsorbs on the DEAE ion exchange surface and its thickness varies with pH. Under pH5.0, the average thickness of adsorption layer is higher than that of HBsAg-VLPs particles. At the pH value of 7.0 or 9.0, the average thickness of the adsorbed layer is smaller than the diameter of the HBsAg-VLPs particles, which indicates that the virus like particles may exhibit complex structural changes in ion exchange. By comparing the experimental results of DPI analysis and ion exchange chromatography purification, it is proved that the loss of HBsAg-VLPs activity in ion exchange chromatography is closely related to the interfacial inactivation. 4) A strategy to improve the stability of granular antigen in the process of production is established. For FMDV, the optimum range of pH is 7.5-8.0, and the most suitable salt is ammonium salt. HPSEC and differential scanning calorimetry (DSC) showed that the addition of polyhydroxyl compounds could stabilize the particle structure of vaccine antigen. When polyhydroxyl compounds were present in the solution, the yield of FMDV in ultrafiltration process was increased by 10.4%, and the yield of ion exchange chromatography was increased from 17.1% to 84.0%. The purity of the whole FMDV particles (146S) was above 98% and the overall yield was 56.7%.
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院(過程工程研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392

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