【摘要】：支氣管肺發(fā)育不良(bronchopulmonary dysplasia, BPD)是早產(chǎn)兒常見的呼吸系統(tǒng)疾病,其典型的病理改變?yōu)闅獾澜Y構異常和肺泡發(fā)育不良,具體表現(xiàn)為氣道上皮細胞分化異常,肺泡數(shù)量減少,肺泡結構破壞,肺泡問質(zhì)增生等結構功能的改變。BPD的發(fā)病機制仍不十分清楚,目前發(fā)現(xiàn)的可能的致病因素包括：早產(chǎn)、子宮內(nèi)環(huán)境、氧氣治療和機械通氣,感染與炎癥等因素。除了以上外在因素外,遺傳因素異常在BPD的發(fā)生過程也有重要意義,但是目前對BPD模型的表觀遺傳學的研究較少,本研究將從發(fā)育生物學的角度來探究表觀遺傳學因素在BPD發(fā)生過程中的的作用機制。表觀遺傳學是研究沒有DNA序列變化的,但可遺傳的基因表達的改變。組蛋白修飾是表觀遺傳學研究的一個重要方向,包括乙�；�,甲基化,磷酸化以及核糖基化等。調(diào)控組蛋白乙�；腿ヒ阴；氖且粚δ芟嗷マ卓沟牡鞍酌�,其中乙�；山M蛋白乙�；D(zhuǎn)移酶(Histone acelyltransferase, HAT)催化完成,去乙�；瘎t由組蛋白去乙�；�(Histone deacelylase, HDAC)介導。目前的研究發(fā)現(xiàn)的哺乳動物的HDACs總計18種,按照其結構和功能分為4組,分別為Ⅰ型,Ⅱa型,Ⅱb型和Ⅳ型。Ⅰ型HDACs家族包含四個成員,分別是HDAC1,HDAC2, HDAC3和HDAC8。HDACs被證明在促進細胞的增殖和抑制凋亡過程中發(fā)揮重要作用。除此之外,隨著近年來小鼠同源重組和基因敲除技術的進步,人們發(fā)現(xiàn)HDACs在多種器官的發(fā)育過程中也發(fā)揮不同的組織特異性功能。本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型HDACs(HDAC1、HDAC 2和HDAC 3)在整個小鼠胚胎發(fā)育過程中在肺內(nèi)廣泛、持續(xù)表達,提示其在肺器官發(fā)育過程中中可能發(fā)揮重要作用。在肺上皮細胞內(nèi)組織特異性敲除HDAC1和HDAC2基因,會導致肺的近端氣道(proximal airway)發(fā)育不良。同樣,在肺上皮細胞中敲除HDAC3基因,會抑制在肺泡Ⅰ型上皮細胞(AT1)在肺發(fā)育晚期肺泡形成階段的重塑功能,導致AT1擴張障礙和肺泡塌陷。除了肺上皮細胞內(nèi),HDAC3在整個胚胎發(fā)育階段同時也肺間質(zhì)細胞內(nèi)廣泛表達,在本研究中,我們構建HDAC3組織特異性敲除小鼠模型來探明肺間質(zhì)細胞中HDAC3缺失導致小鼠肺發(fā)育不全的作用機制。第一部分：HDAC3基因缺失導致小鼠肺發(fā)育不良為了研究為了研究HDAC3基因在小鼠胚胎肺發(fā)育中的重要作用,我們首先要明確在胚胎發(fā)育的不同時期HDAC3基因在小鼠肺內(nèi)的表達模式。我們對胚胎發(fā)育各個時期的肺組織切片進行HDAC3免疫熒光染色,實驗結果顯在肺發(fā)育的整個過程中,HDAC3在肺上皮細胞和間質(zhì)細胞中持續(xù)而廣泛的表達,我們可以推測HDAC3在小鼠肺發(fā)育過程中可能發(fā)揮重要的作用。為了進一步研究肺間質(zhì)細胞中HDAC3基因在肺發(fā)育過程中的作用機制,我們利用Cre-loxP系統(tǒng)組織特異性敲除目的基因。我們在HDAC3基因4-7號外顯子兩端分別插入一個LoxP位點,在Cre酶作用下將HDAC3基因的4-7號外顯子將被切除。Dermo1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠是間質(zhì)細胞特異性轉(zhuǎn)基因小鼠,該小鼠的Cre重組酶活性由間質(zhì)細胞特異性蛋白Dermo1基因的啟動子調(diào)控,可達到在間質(zhì)細胞特異性表達Cre重組酶的目的。我們將HDAC3flox/flox轉(zhuǎn)基因小鼠與Dermo1-Cre+/-轉(zhuǎn)基因小鼠雜交,獲得HDAC3flox/+;Dermo1Cre+/-基因型小鼠后代,后者再次與HDAC3flox/flox小鼠雜交后可獲得敲除兩個HDAC3基因的純合體。(HDAC3flox/flox;Dermo1 Cre+/-基因型,又記作HDAC3Dermo1CreKO)分別于小鼠胚胎發(fā)育的不同時期解剖小鼠取胚胎肺,對其進行基因組鑒定,部分肺葉組織固定包埋切片,用于HE染色和免疫熒光染色。部分肺組織加入細胞裂解液提取總RNA,用于Q-PCR分析實驗。我們通過免疫熒光染色來檢測Dermo1-Cre重組酶的效率,發(fā)現(xiàn)在肺間質(zhì)細胞中幾未檢測出HDAC3蛋白,提示雜交小鼠在Cre重組酶的作用下有效敲除了在肺間質(zhì)細胞中的HDAC3基因。95%以上的HDAC3Dermo1CreKO基因型的新生小鼠在出生后幾小時內(nèi)因呼吸窘迫死亡。組織學分析實驗發(fā)現(xiàn),HDAC3Dermo1CreKO基因型的小鼠胚胎肺較野生型(WT)對照組略減小,但肺葉數(shù)量和位置未見異常,肺葉邊緣不規(guī)整,提示存在肺間質(zhì)發(fā)育不良。高倍鏡視野下可見氣道分枝化形態(tài)發(fā)生正常,提示HDAC3不是氣道分枝化形態(tài)發(fā)生的必要因素。E18.5肺組織切片的HE染色顯示實驗組小鼠的肺泡數(shù)量減少,部分肺泡塌陷,肺間隔顯著增厚,肺擴張存在明顯障礙。肺泡發(fā)育畸形導致無法形成有效的氣體交換平面以建立正常的呼吸功能,是新生小鼠致死的主要原因。。綜上所述,肺間質(zhì)細胞中HDAC3的重要作用可能貫穿整個小鼠胚胎肺發(fā)育過程,早期HDAC3基因缺失導致肺間質(zhì)發(fā)育不良,但是不會影響肺上皮細胞的分枝化形態(tài)發(fā)生過程。在胚胎發(fā)育的晚期原始肺泡發(fā)育階段,HDAC3基因缺失會導致遠端氣道的發(fā)育缺陷。HDAC3具體以何種機制參與到肺泡晚期遠端氣道的組織分化調(diào)控,是我們下一步的研究重點。第二部分：HDAC3在小鼠肺間質(zhì)細胞增殖和分化過程中的作用第一部分的組織學分析結果顯示,HDAC3DermolCreKO基因型小鼠胎肺較野生型(WT)明顯減小,由此我們推測肺間質(zhì)細胞HDAC3基因缺失導致的肺發(fā)育不良可能是由于肺上皮細胞或者肺間質(zhì)細胞的增殖能力下降所引起的。為了評估HDAC3Dermo1CreKO基因型小鼠肺發(fā)育過程中肺內(nèi)細胞增殖是否受到抑制,我們對胚胎發(fā)育不同時期的肺組織切片行PO4-H3免疫熒光染色和TTF-1、BrdU雙重染色以檢測細胞增殖率,統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)PO4-H3和TTF-1-BrdU+細胞比例與對照組(WT)相比明顯減少,TTF-1+BrdU+細胞占總細胞數(shù)百分比無明顯變化,說明腫間質(zhì)細胞內(nèi)HDAC3缺失直接影響肺間質(zhì)細胞的增殖能力,但是肺上皮細胞的增殖未受到影響。眾所周知,HDACs會通過調(diào)節(jié)基因表達來參與細胞周期的調(diào)節(jié),主要通過細胞周期蛋白依賴激酶(CDKs)、細胞周期蛋白(Cyclins)的正向調(diào)控和細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子(CKIs)的負向調(diào)控來實現(xiàn)。我們對HDAC3Dermo1CreKO基因型小鼠肺組織內(nèi)表達的細胞周期相關因子進行Q-PCR分析發(fā)現(xiàn),在肺間質(zhì)細胞HDAC3基因缺失的小鼠肺組織內(nèi),細胞周期蛋白CyclinA2、CyclinB1、 CyclinD1和CDK1的mRNA表達水平顯著下降；P27的mRNA表達較對照組顯著升高,其他相關細胞周期蛋白和激酶無明顯變化。這個結果與早前研究報道相一致,提示HDAC3是通過細胞周期相關因子來參與調(diào)控細胞周期以達到控制細胞生長的目的,而其中的具體的分子生物學機制尚未完全清楚,可能是一個多因素參與的復雜過程。在肺發(fā)育的過程中,肺間質(zhì)細胞會發(fā)育分化成多種細胞系,如平滑肌細胞(smooth muscle cells)、內(nèi)皮細胞(endothelial cells)、周細胞(pericytes)和間質(zhì)成纖維細胞(interstitial fibroblasts)。為了研究HDAC3對肺中胚層來源的細胞系分化的影響,我們對轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織切片行特異性細胞標志物免疫熒光染色。1.小鼠肺組織切片行Sox2和SM22雙重免疫熒光染色,結果顯示HDAC3Dermo1CreKO轉(zhuǎn)基因小鼠氣道平滑肌未見異常,提示肺間質(zhì)細胞特異性敲除HDAC3未影響間質(zhì)細胞源性平滑肌細胞的分化。2.內(nèi)皮細胞標志蛋白Pecam表達在HDAC3基因缺失的肺組織內(nèi)未見異常,Q-PCR結果顯示內(nèi)皮細胞特異性標志物的mRNA表達與蛋白表達水平相-致,說明HDAC3未參與肺內(nèi)皮細胞分化的調(diào)控。3. 間質(zhì)成纖維細胞幾個重要標志物Pdgfr-b和Vmentin的蛋白和mRNA表達在HDAC3基因缺失的小鼠肺組織中顯著降低。HDAC3Dermo1CreKO轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型對照小鼠的肺組織中分離的肺間質(zhì)細胞進行體外培養(yǎng),免疫熒光染色結果顯示Ki67+和Pdgfr-b+細胞占總細胞的百分比明顯降低,提示肺間質(zhì)細胞特異性敲除HDAC3影響肺間質(zhì)來源的成纖維細胞的增殖和分化。第三部分HDAC3在小鼠肺泡Ⅰ型上皮細胞分化過程中作用機制的研究小鼠胚胎發(fā)育至E17.5,肺的發(fā)育由氣道分枝化形態(tài)發(fā)生階段進入原始肺泡形成階段。這個階段包含遠端氣道末端擴張呈囊和肺泡上皮細胞分化兩個主要的發(fā)育過程。為了研究肺間質(zhì)細胞HDAC3基因缺失是否影響肺上皮細胞的分化,我們采用組織切片免疫熒光染色和Q-PCR分析來檢測肺上皮細胞的細胞標志物的蛋白和mRNA表達：1.肺泡1型上皮細胞(AEC 1)的細胞標志物AQP-5和T1-alpha的蛋白和mRNA表達在HDAC3Dermo1CreKO轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織中明顯減低,提示AEC 1細胞分化障礙。2.肺泡Ⅱ型上皮細胞(AEC 2)的細胞特異性標志物Sftpc、Sftpb和Abca在HDAC3Dermo1CreKO轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織的表達未見明顯異常,說明肺間質(zhì)細胞特異性敲除HDAC3未影響AEC 2細胞的分化和成熟。3.纖毛上皮細胞特異性細胞標志物Foxj1和beta-tublin Ⅳ,分泌細胞標志物Scbg1a1,HDAC3Dermo1CreKO轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織中這些近端氣道的上皮細胞的標志物的表達與對照組相比(WT)無明顯差異,提示HDAC3基因不參與肺近端氣道上皮細胞的分化和發(fā)育的調(diào)控。為了研究肺間質(zhì)細胞內(nèi)HDAC3缺失導致肺泡擴張障礙和AEC 1細胞分化不全的的分子機制,我們采用磁珠分選的方法分離肺上皮細胞和間質(zhì)細胞,并對其進行Q-PCR分析。實驗結果顯示HDAC3缺失的EpCAM-的肺間質(zhì)細胞中配體Wnt2和Wnt5的表達明顯下降；EpCAM+的肺上皮細胞中配體Wnt5a和Wnt7a表達同樣受到抑制,經(jīng)典Wnt信號通路中常見的目的基因Axin2、Lef-1和CyclinD1的表達明顯減低。以上實驗結果證實肺間質(zhì)細胞特異性敲除HDAC3會抑制Wnt信號通路配體的表達,進一步導致經(jīng)典Wnt/p-catenin信號通路的活性下降。HDAC3在胚胎肺發(fā)育晚期的肺泡擴張和AEC1分化成熟的過程發(fā)揮重要作用,體外肺組織培養(yǎng)實驗驗證了在胚胎肺發(fā)育晚期抑制Wnt/β-catenin信號通路活性可以造成肺發(fā)育晚期AEC1分化缺陷,同時挽救實驗中在胚胎發(fā)育晚期給孕鼠腹腔注射Wnt信號通路激動劑LiCI可以緩解肺間質(zhì)細胞HDAC3缺失導致的肺發(fā)育不良。由此我們可以得出結論,肺間質(zhì)細胞內(nèi)的HDAC3對肺發(fā)育晚期AEC1的分化成熟具有重要意義,HDAC3Dermo1CreKO轉(zhuǎn)基因的小鼠的肺內(nèi)AEC1的分化缺陷是由于肺上皮細胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號通路活性減低所引起的,而HDAC3作為上游的調(diào)控因子對Wnt/β-catenin信號通路活性發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R321

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 Fulmer JD ,王力珩;肺間質(zhì)病[J];國外醫(yī)學(衛(wèi)生學分冊);1984年05期

2 張志勇;;小兒急性肺水腫[J];醫(yī)師進修雜志;1983年02期

3 王建國,卞振錚,劉梅;利福平致肺間質(zhì)肺炎1例[J];現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志;1998年12期

4 張秀勤;;肺間質(zhì)炎間質(zhì)纖維化治驗[J];河北中醫(yī);1989年03期

5 黃莉萍,岳鑫,郭紅,丁亞珍;繼發(fā)性彌漫性雙肺間質(zhì)肉芽腫1例[J];解放軍保健醫(yī)學雜志;2003年01期

6 李晶;江淳涓;;中西醫(yī)結合療法治療肺間質(zhì)病臨床觀察[J];遼寧中醫(yī)雜志;2013年04期

7 金玲,張永紅 ,趙順英 ,吳潤暉 ,申昆玲 ,吳敏媛;第115例——發(fā)熱、咳嗽、肺間質(zhì)改變[J];中華兒科雜志;2004年07期

8 汪謀岳;肺間質(zhì)病患者肺泡巨噬細胞蛋白激酶C活性的變化[J];中華醫(yī)學信息導報;2000年16期

9 劉發(fā)堂,丁寶維;繼發(fā)性彌漫性雙肺間質(zhì)肉芽腫一例[J];海南醫(yī)學;2005年09期

10 李煒清;;1例特發(fā)性肺間質(zhì)肺炎危重癥患者的藥學監(jiān)護[J];中國藥師;2013年06期

相關會議論文 前1條

1 時一添;;原發(fā)性干燥綜合征伴肺間質(zhì)損害患者血清中白細胞介素-17水平及其臨床意義的研究[A];第17次全國風濕病學學術會議論文集[C];2012年

相關重要報紙文章 前1條

1 本報記者 王海蘊;肺間質(zhì)病不可怕[N];中國消費者報;2001年

相關博士學位論文 前1條

1 王小如;組蛋白去乙�；�3在小鼠胚胎肺發(fā)育過程中作用機制的研究[D];山東大學;2016年

相關碩士學位論文 前1條

1 胡華;u-PA及PAI-1在小鼠實驗性肺氣腫發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制[D];復旦大學;2008年

，

本文編號：2376582