本文選題：帕金森病 + 內(nèi)源性神經(jīng)毒素　； 參考：《北京理工大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是世界上第二大神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為損害患者的運(yùn)動(dòng)機(jī)能，出現(xiàn)靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)緩慢等臨床癥狀，因此嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。自從發(fā)現(xiàn)外源性神經(jīng)毒素MPTP可以造成多巴胺能神經(jīng)元特異性死亡之后，內(nèi)源性MPTP結(jié)構(gòu)類似物越來(lái)越受到關(guān)注，特別是在腦內(nèi)由多巴胺代謝生成的兒茶酚胺異喹啉（catecholamine isoquinolines，CAIQs）物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)室在多年研究基礎(chǔ)上，提出了CAIQs在腦內(nèi)形成與代謝的假說(shuō)，其中由氮甲基轉(zhuǎn)移酶催化salsolinol（Sal）生成氮甲基產(chǎn)物N-methy-salsolinol （NMSal）是造成神經(jīng)毒性顯著增強(qiáng)的關(guān)鍵步驟�；诖思僬f(shuō)，進(jìn)一步開展內(nèi)源性神經(jīng)毒素對(duì)黑質(zhì)神經(jīng)元損傷分子機(jī)制研究，并發(fā)展早期診斷的生物標(biāo)志物候選物，將有助于為PD的發(fā)病機(jī)制、早期診斷研究提供理論基礎(chǔ)。 本課題圍繞PD中神經(jīng)損傷相關(guān)蛋白標(biāo)志物和疾病早期診斷標(biāo)志物的候選物研究，開展兩方面的工作：基于Sal氮甲基轉(zhuǎn)移酶（SNMT）在內(nèi)源性神經(jīng)毒素形成神經(jīng)元損傷中的關(guān)鍵作用，發(fā)展基于質(zhì)譜技術(shù)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)定量方法，以達(dá)到對(duì)SNMT活性高靈敏度和高選擇性測(cè)定和進(jìn)一步驗(yàn)證假說(shuō)的目的，為后續(xù)開展生物標(biāo)志物的分析檢測(cè)建立方法學(xué)基礎(chǔ)；另一方面，通過(guò)18O標(biāo)記的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法開展神經(jīng)功能損傷差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究，為了解疾病相關(guān)的神經(jīng)功能變化提供蛋白質(zhì)組學(xué)的概貌，并通過(guò)腦部與外周差異蛋白的相關(guān)性分析，為后續(xù)臨床診斷生物標(biāo)志物的篩選提供參考。主要研究?jī)?nèi)容和研究結(jié)果如下： 1、針對(duì)SNMT酶活測(cè)定中的產(chǎn)物NMSal，開展基于多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（Multiple reactionmonitoring，MRM）技術(shù)的兒茶酚異喹啉類化合物NMSal的高靈敏度定量方法。質(zhì)譜檢測(cè)離子對(duì)為NMSal （194.1→145.1），方法學(xué)的評(píng)價(jià)表明NMSal的最低檢測(cè)限達(dá)49pM，最低定量限為98pM，定量范圍在0.098nM~100nM，線性相關(guān)系數(shù)大于0.9995，具有較好的日內(nèi)精密度和日間精密度（均小于15.0%），較好的準(zhǔn)確度（94.0%~112.5%），以及較好的方法回收率（81.0%~91.4%），保證了在復(fù)雜生物體系中對(duì)NMSal的高靈敏度、高選擇性以及高準(zhǔn)確性的定量檢測(cè)要求。 2、通過(guò)對(duì)NMSal的定量檢測(cè)，測(cè)定了6-OHDA單側(cè)損毀的PD模型大鼠中SNMT活性。其中PD模型大鼠采用6-OHDA單側(cè)損毀紋狀體的方式構(gòu)建，通過(guò)行為學(xué)和形態(tài)學(xué)的評(píng)價(jià)結(jié)果顯示建模成功率達(dá)60%，模型組黑質(zhì)部位多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目與假手術(shù)對(duì)照組相比顯著減少（p0.01）。SNMT活性的結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD模型大鼠紋狀體、黑質(zhì)和血液淋巴細(xì)胞中SNMT活性與假手術(shù)對(duì)照大鼠相比均顯著升高（紋狀體：p0.05；黑質(zhì)與淋巴細(xì)胞：p0.01），活性在外周淋巴細(xì)胞變化趨勢(shì)與在腦部變化的趨勢(shì)一致，該結(jié)果不僅說(shuō)明SNMT及其活性與CAIQs在腦內(nèi)形成與代謝有關(guān)，而且進(jìn)一步證實(shí)SNMT的活性可能在外周血液中有所反映，有可能作為早期診斷的標(biāo)志物。 3、開展了抑制off-gel分離中18O標(biāo)記回標(biāo)的方法研究。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白牛血清白蛋白BSA的考察結(jié)果表明，通過(guò)超濾去除游離酶后，18O標(biāo)記的肽段在off-gel分離中沒(méi)有出現(xiàn)明顯回標(biāo)現(xiàn)象，標(biāo)記效率為95.5±2.5%，肽段的平均回收率為80.6±10.8%，16O與18O標(biāo)記的肽段混合物1:1混合后的比值為0.99±0.17。此外，生物樣品經(jīng)過(guò)超濾法去除游離酶和off-gel分離之后，90%以上的蛋白定量比值為1.04±0.16，滿足定量蛋白質(zhì)組學(xué)的要求，有助于定量蛋白質(zhì)組學(xué)中18O標(biāo)記方法與off-gel分離的聯(lián)用。 4、采用基于18O標(biāo)記的二維液相色譜質(zhì)譜法，對(duì)6-OHDA單側(cè)損毀的PD模型大鼠中紋狀體和黑質(zhì)的蛋白進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)、及疾病狀態(tài)下神經(jīng)損傷的分子機(jī)制的深入研究。紋狀體的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示當(dāng)肽段FDR1.0%時(shí)，共有1232張肽段-質(zhì)譜匹配圖，以及370個(gè)蛋白得到定性和定量分析，76個(gè)蛋白差異表達(dá)；黑質(zhì)的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示當(dāng)肽段FDR1.0%時(shí)，共有8349張肽段-質(zhì)譜匹配圖，以及1344個(gè)蛋白得到定性和定量分析，93個(gè)蛋白差異表達(dá)。通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析和文獻(xiàn)對(duì)數(shù)據(jù)的支持與解讀，并基于單側(cè)損毀的PD模型大鼠中紋狀體和黑質(zhì)的氧化應(yīng)激水平增高現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)功能損傷相關(guān)的蛋白變化情況主要體現(xiàn)在：（1）參與糖酵解過(guò)程的蛋白和線粒體蛋白分別表達(dá)上調(diào)和表達(dá)下調(diào)，包括紋狀體中7個(gè)線粒體蛋白表達(dá)下調(diào)，3個(gè)參與糖酵解過(guò)程的蛋白表達(dá)上調(diào)，黑質(zhì)中5個(gè)線粒體蛋白表達(dá)下調(diào)，3個(gè)參與糖酵解過(guò)程的蛋白表達(dá)上調(diào)，與PD密切相關(guān)的這兩個(gè)腦區(qū)中均顯示出糖酵解和線粒體功能的蛋白水平協(xié)同的差異表達(dá)，提示疾病過(guò)程中的能量代謝發(fā)生障礙，線粒體功能受損，ATP供能不足，糖酵解過(guò)程的蛋白表達(dá)上調(diào)以發(fā)揮能量代償作用；（2）紋狀體中22個(gè)下調(diào)蛋白是囊泡組分，含10個(gè)參與神經(jīng)元囊泡的傳遞和回收組分，這些蛋白構(gòu)成以SNARE復(fù)合體為核心的突觸蛋白及其附屬蛋白，和以網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞過(guò)程相關(guān)蛋白，并對(duì)突觸融合蛋白（syntaxin-1A）進(jìn)行了生物學(xué)驗(yàn)證，與質(zhì)譜結(jié)果一致，表明6-OHDA單側(cè)損毀的PD大鼠模型中，其紋狀體的胞吞胞吐功能受損，參與了疾病的發(fā)病進(jìn)程；（3）黑質(zhì)的差異表達(dá)蛋白顯示13個(gè)蛋白在免疫應(yīng)答生物學(xué)過(guò)程中顯著聚集，包括小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞活化和增殖的蛋白3個(gè)、炎癥反應(yīng)與免疫蛋白8個(gè)、維持鈣平衡和神經(jīng)保護(hù)作用的蛋白2個(gè)，其中對(duì)血清白蛋白（serum albumin）進(jìn)行生物學(xué)驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果與質(zhì)譜結(jié)果一致，免疫相關(guān)蛋白的差異表達(dá)提示隨疾病進(jìn)程中關(guān)鍵病變區(qū)的免疫功能異常。 5、基于18O標(biāo)記的差異蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)6-OHDA單側(cè)損毀的PD大鼠模型中血液淋巴細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，淋巴細(xì)胞中參與糖酵解過(guò)程的蛋白表達(dá)上調(diào)，免疫應(yīng)答相關(guān)的蛋白表達(dá)上調(diào)，此外，與假手術(shù)對(duì)照組相比，PD模型組的大鼠白細(xì)胞數(shù)目和淋巴細(xì)胞數(shù)目極顯著增加（p0.01），表明疾病狀態(tài)下機(jī)體存在炎癥反應(yīng)，對(duì)大鼠的外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)一步的細(xì)胞亞群分型可以發(fā)現(xiàn)，CD4+/CD8+的比值降低（p0.01），提示疾病進(jìn)程中機(jī)體活躍的免疫反應(yīng)，存在免疫功能異常，并且主要是由T輔助細(xì)胞（CD4+）的百分比降低所致；外周和腦部差異蛋白的相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)共17個(gè)蛋白在淋巴細(xì)胞和黑質(zhì)部位差異表達(dá)，相關(guān)系數(shù)為0.45，說(shuō)明這17個(gè)差異蛋白在外周和腦部的變化具有一致性，存在一定的相關(guān)程度，其中在外周與腦部的表達(dá)均為上調(diào)的差異蛋白共7個(gè)，變化趨勢(shì)的相關(guān)系數(shù)為0.89，進(jìn)一步說(shuō)明外周與腦部差異蛋白表達(dá)水平的趨勢(shì)一致，相關(guān)程度增加，外周淋巴細(xì)胞蛋白的變化能夠反映出腦部的蛋白變化，同時(shí)主成分分析可以發(fā)現(xiàn)，果糖二磷酸醛縮酶A、甘油醛3-磷酸脫氫酶、6-磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶在淋巴細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，在黑質(zhì)中無(wú)明顯差異表達(dá)，提示疾病發(fā)生過(guò)程中，，外周淋巴細(xì)胞對(duì)能量需求的敏感性高，以發(fā)揮其免疫監(jiān)視、免疫應(yīng)答的作用，纖維蛋白原、血清白蛋白、補(bǔ)體C3、轉(zhuǎn)凝蛋白-2和α-輔肌動(dòng)蛋白均表現(xiàn)為外周與腦部表達(dá)上調(diào)的趨勢(shì)，并且蛋白變化的相關(guān)系數(shù)為0.95，提示免疫功能相關(guān)蛋白參與了疾病的發(fā)病進(jìn)程，表現(xiàn)為外周和腦部均存在免疫反應(yīng)，其蛋白水平能夠反映外周與腦部變化趨勢(shì)，可為后續(xù)臨床診斷指標(biāo)提供研究基礎(chǔ)和候選參考。 綜上所述，基于質(zhì)譜技術(shù)手段，不僅能夠準(zhǔn)確定量單一目標(biāo)，也能反映生物機(jī)體內(nèi)整體蛋白質(zhì)的表達(dá)情況概貌。從蛋白質(zhì)的水平表征疾病進(jìn)程中的變化，包括神經(jīng)功能損傷和疾病標(biāo)志物的研究，對(duì)提高早期診斷的正確率、合理分類亞型、監(jiān)測(cè)病情進(jìn)展和評(píng)估神經(jīng)保護(hù)治療的療效具有重要作用，可作為后續(xù)研究的參考。
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【學(xué)位授予單位】：北京理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R742.5;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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1 王冉;慶宏;劉曉茜;鄭曉琳;鄧玉林;;鐵離子促進(jìn)過(guò)量多巴胺引起SH-SY5Y細(xì)胞兒茶酚異喹啉物質(zhì)生成和氧化損傷(英文)[J];Neuroscience Bulletin;2008年03期

本文編號(hào)：1939134